dc.contributor.author
Xu, Hai
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:40:44Z
dc.date.available
2002-10-07T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8270
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12469
dc.description
Title and Contents
Acknowledgements
1\. Introduction 1
2\. Materials and Methods 13
3\. Results 39
4\. Discussion 89
5\. Reference 105
6\. Publications 117
7\. Appendix 118
Summary
dc.description.abstract
Helicases are ubiquitious motor proteins essential in key biological processes
which require single-stranded DNA (ssDNA) such as DNA replication,
transcription, repair and recombination. In this thesis, various methods have
been used to study the properties of the enzyme RepA and its function and
mechanism. RepA is the first intact hexameric replicative DNA helicase (from
plasmid RSF1010) whose three-dimensional structure is known in detail. The six
ATP binding sites of RepA are each located at the interfaces between two
adjacent monomers and belong to Walker A and B-motifs, corresponding to motifs
H1 and H2 of the DnaB-like helicase family. They are defined by the consensus
sequence for the P loop 40GAGKS44 and residues Asp140, Glu77, His179
(belonging to the same monomer) and Arg207 (from the adjacent monomer).
Nucleotide binding to RepA shows a strong negative cooperativity. Although
there are six potential ATP binding sites in the RepA hexamer, fluorescence
measurements show that only three sites can be occupied by the ATP analogue
TNP-ATP. RepA is more stable in the presence of ATPgS than in the presence of
ADP (DDG = 0,29 kcal/mol), indicating that the additional phosphate group in
ATPgS has a significant influence on RepA structure. Circular dicroism, X-ray
and electron microscopic studies show that nucleotide binding to RepA induces
conformational changes. Fluorescence depolarization measurements further show
dynamic segment movements around the ATP active site upon ATP binding,
hydrolysis and ssDNA binding. ssDNA stimulates RepA ATPase activity optimally
at acidic pH 5.3-6.0. The sigmoidal kinetic curves both in the absence and
presence of ssDNA show strong positive cooperativity for ATP hydrolysis, with
oligonucleotides longer than 10mer optimal for ssDNA stimulated ATPase
activity. Mutation of Lys43 (Walker A motif) to alanine abolishes ATP binding
and hydrolysis activity, indicating that this lysine is essential in the
Walker A motif in DnaB-like helicase family. Fluorescence correlation
spectroscopy (FCS) and analytic ultracentrifugation were used to characterize
the interaction of fluorescence labeled ssDNA with RepA. Equilibrium binding
of ssDNA to RepA was only optimal in the presence ATPgS at pH 5.8. In the
absence of ATPgS or at pH 7.6, complex formation between ssDNA and RepA was
rather weak. Binding curves are compatible with one binding site for ssDNA
present on RepA, with no indication of cooperativity. Protein-DNA photo-
crosslinking studies further show that only one subunit from the hexamer
helicase is involved in the interaction with ssDNA at the same time and
preclude the possibility of extensive wrapping of the ssDNA around the hexamer
and formation of the complex in which all six protomers are simultaneously
bound to ssDNA. RepA served as a model helicase to search for inhibitory
compounds. The commercially available flavone derivatives luteolin, morin,
myricetin and dimyricetin (an oxidation product of myricetin) inhibit the
ATPase and dsDNA unwinding activities of RepA. Dimyricetin was the most
effective inhibitor for both activities. Single-stranded DNA-dependent RepA
ATPase activity is inhibited noncompetitively by all four compounds. Myricetin
also inhibited the growth of a Gram-positive and a Gram-negative bacterial
species and these flavones may provide lead structures for the design of
molecules helpful for unraveling the mechanism of helicase action and for the
design of novel pharmacologically useful molecules. A model is proposed in
which RepA helicase sequencely hydrolyses ATP, translocates on ssDNA and
unwinds DNA.
de
dc.description.abstract
Helikasen sind ubiquitäre Motorproteine. Sie sind unentbehrlich für
essentielle biologische Prozesse mit Beteiligung einzelsträngiger DNA (ssDNA)
wie DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination. Im Rahmen dieser
Doktorarbeit wurden Funktion und Reaktionsmechanismen der Helikase RepA mit
Hilfe unterschiedlicher Methoden untersucht. Die dreidimensionale Struktur von
RepA (aus Plasmid RSF1010) ist bis ins Detail bekannt. RepA war die erste
intakte hexamere replikative Helikase, deren Struktur gelöst wurde. RepA
besitzt sechs ATP-Bindungsstellen, die auf den Grenzflächen zwischen zwei
benachbarten Monomeruntereinheiten liegen. Die ATP-Bindungsstellen gehören zu
den Walker A- und B-Motiven und enthalten die H1- und H2- Motive der DnaB-like
Familie. Die Motive sind durch die Konsenssequenz für den P-Loop 40GAGKS44 und
die Reste Asp140, Glu77, His179, die alle demselben Monomer angehören, und den
Rest Arg207, der auf dem benachbarten Monomer liegt, definiert.
Nukleosidtriphosphate-Bindung durch RepA zeigt eine streng negative
Kooperativität. Obwohl es sechs potentielle ATP-Bindungsstellen im RepA-
Hexamer vorhanden sind, zeigen Fluoreszenzmessungen, dass lediglich drei von
ihnen durch ATP-Analoga besetzt werden. RepA ist in Anwesenheit von ATPgS
stabiler als in Anwesenheit von ADP (?G = 0,29 kcal/mol), die zusätzliche
Phosphatgruppe in ATPgS hat einen signifikanten Einfluß auf die RepA-
Stabilität. ZirkularDichroismus, Röntgen- und Elektronmikroskopie zeigen, dass
die ATT-Bindung eine Konformationsänderung in RepA bewirkt. Ferner zeigen
Messungen der Fluoreszenzdepolarisation Bewegungen eines Segments um die ATP-
Bindungsstelle herum während der ATP-Bindung, ATP-Hydrolyse und ssDNA-Bindung.
ssDNA stimuliert die ATPase-Aktivität von RepA unter sauren Bedingungen bei pH
5.3-6.0. Der sigmoidale Verlauf der Bindungskurven in An- und Abwesenheit von
ssDNA deuten auf streng positive Kooperativität der ATP-Hydrolyse, wobei die
zehn Basen langen Oligonukleotide optimale Stimulatoren der ATPase-Aktivität
sind. Lys43 (Walker A-Motiv) ist ein essentieller Rest bei Enzymen der DnaB-
like Helikase-Familie. Der Austausch von Lys43 (Walker A-Motiv) gegen Alanin
verhindert die ATP-Bindung und hydrolytische Aktivität. Die Interaktion von
RepA-Hexamer mit fluoreszenzmarkierter ssDNA wurde mit Hilfe von Fluoreszenz
Korrelations Spektroskopie (FCS) und analytischer Ultrazentrifugation
untersucht. Eine optimale Bindung von ssDNA durch RepA konnte nur in
Anwesenheit von ATPgS und bei pH 5.8 erreicht werden. Ohne ATPgS oder bei pH
7.6 war die Komplexbildung schwach. Die Bindungskurven zeigten keine
Kooperativität und deuteten auf nur eine ssDNA-Bindungsstelle auf RepA.
Protein-DNA Photo-Crosslinking Untersuchungen zeigten ferner, dass nur eine
Untereinheit der Helikase zur selben Zeit an der Interaktion mit DNA beteiligt
ist. Dies schließt die Möglichkeit extensiver Windung der ssDNA um das Hexamer
herum aus. Ein Komplex mit simultaner Bindung der DNA durch alle sechs
Untereinheiten konnte nicht beobachtet werden. RepA diente als Modellhelikase
bei der Suche nach Inhibitoren. Kommerziell erhältliche Flavon-Derivate wie
Luteolin, Morin, Myricetin und Dimyricetin ( ein Oxidationsprodukt von
Myricetin) inhibieren die ATPase- und Entwindungsaktivität von RepA.
Dimyricetin inhibiert beide Aktivitäten am effektivsten. Alle vier Substanzen
inhibieren nicht-kompetitiv die ssDNA-abhängige ATPase-Aktivität vom RepA.
Myricetin inhibiert bekanntlich auch das Wachstum grampositiver und
gramnegativer Bakterien. Diese Flavone könnten daher als Basisstrukturen für
die Entwicklung neuer pharmazeutischer Stoffe dienen. Im Rahmen der Arbeit
wurde ein Modell der ATP-Hydrolyse, Translokation entlang der ssDNA und
Entwindung des DNA Doppelstrangs vorgeschlagen.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
DNA helicase RepA
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Biochemical and structural studies on the function of RepA DNA helicase from
plasmid RSF1010
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Wolfram Saenger
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Eberhard Riedel
dc.date.accepted
2002-09-20
dc.date.embargoEnd
2002-10-10
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002002097
dc.title.translated
Biochemische und strukturelle Studien der Funktion von RepA DNA Helikase aus
Plasmid RSF1010
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000000574
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/209/
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open access