Neuromodulatorische Wirkungen von Lysophosphatidsäure in vitro – Untersuchungen in der Maus

Abstract

Dem bioaktiven Phospholipid Lysophosphatidsäure (LPA) wird ein Einfluss auf Zellproliferation, Apoptose, Migration und Entwicklung im Nervensystem zugeschrieben, häufig über eine Erhöhung des intrazellulären Calciums. Die LPA-Wirkungen werden über G-Protein gekoppelte LPA-Rezeptoren vermittelt. Vor dem Hintergrund des Nachweises von LPA-Rezeptoren im Gehirn und der Anwesenheit von Signalwegen ist das Interesse an LPA-Wirkungen im Gehirn gestiegen. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels der patch-clamp-Technik Aspekte der neuromodulatorischen Wirkung von LPA an Neuronen von Mäusen untersucht. Während der Gehirnentwicklung wurden Funktionen von LPA beschrieben. Eine Familie von LPA abbauenden Enzymen sind die Lipidphosphatphosphatasen (LPP). Im Embryo führt ein verringertes LPP1/1a-Level in neokortikalen Neuronen zu einer retadierten Migration. Da die Entwicklung von Ionenströmen eng mit der Migration von Neuronen gekoppelt ist, wurde in dieser Arbeit ein elektrophysiologisches Profil von diesen Neuronen erstellt. Neurone, die am embryonalen Tag 18 unabhängig vom LPP1/1a-Level ihren Zielort erreichten, unterschieden sich elektrophysiologisch nicht von den Neuronen der Kontrolle. Hingegen waren Neurone, die sich durch Expression von shRNA in tieferen Schichten befanden, nicht in der Lage, regenerative Potenziale zu generieren. Ein wahrscheinlicher Grund war ein ausgeglichenes Verhältnis von einwärts- und auswärtsgerichteten Strömen im Gegensatz zu einem größeren Verhältnis von einwärtsgerichteten Strömen in Kontrollneuronen. Am postnatalen Tag 5 befanden sich diese Neurone in der Schicht 5 und unabhängig von ihrem LPP1/1a- Gehalt waren sie elektrophysiologisch nicht mehr zu unterscheiden. Die Migrationshemmung führte damit zur einer verlangsamten Stromentwicklung und einer anschließenden elektrophysiologischen Reorganisation von betroffenen Neuronen im Neokortex. Im akuten Gehirnschnitt konnte gezeigt werden, dass Neurone der CA1-Region des Hippocampus mit Veränderungen auf LPA reagierten. Extrazellulär appliziertes LPA führte zu einem Anstieg von spontanen exzitatorischen synaptischen Strömen (mEPSCs). Hingegen war die inhibitorische synaptische Transmission durch LPA- Applikation nicht verändert. Die Erhöhung der mEPSC-Frequenz war über die Aktivierung von LPA2-Rezeptoren vermittelt. Zur weiteren Aufklärung des Mechanismus wurde in der primären hippocampalen Neuronenkultur eine genauere Lokalisation des LPA- Effekts untersucht. Im Gegensatz zu Neuronen in akuten Gehirnschnitten wurde in diesem in-vitro Modell nach LPA-Applikation kein Anstieg der Frequenz der mEPSCs gemessen, sondern ein Abfall. Auch hier wurde keine Modulation der inhibitorischen synaptischen Transmission sowie der mEPSCs in LPA2-Rezeptor knock-out-Neuronen beobachtet. Die wahrscheinlichste Modulation durch Calcium wurde im Anschluss untersucht. Die Pufferung von postsynaptischem Calcium verringerte die mEPSC-Frequenz nach LPA. Hingegen war ohne Calcium in der extrazellulären Umgebung keine Reduktion der mEPSCs nach LPA-Applikation zu beobachten. Die gegenläufigen Resultate deuteten darauf hin, dass möglicherweise astrozytäre Faktoren benötigt werden oder andere Kulturartefakte ein Problem sind. Der durch Hyperpolarisation aktivierte, zyklisch-Nukleotid-gesteuerte Kationenstrom Ih kann von G-Proteinsignalwegen moduliert werden. Die Aktivierung von LPA-Rezeptoren könnte daher zu einer Modulation von Ih führen. Eine putative Modulation dieses Stroms wurde an Neuronen der CA1-Region untersucht. Somatische Messungen zeigten keine Veränderung des Stroms. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Rezeptoraktivierung entweder nicht spezifisch ist oder eine Stromveränderung nicht gemessen werden kann. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse machen deutlich, dass Lysophosphatidsäure zu vorübergehenden als auch dauerhaften physiologischen Veränderungen in Neuronen führt. Diese Erkenntnisse können damit den Ausgangspunkt für weiterführende Studien darstellen.

The bioactive phospholipid lysophosphatidic acid (LPA) has an impact on cell- proliferation, apoptosis, cell-migration and development in the central nervous system, often via increases in intracellular calcium [Ca2+]i levels. The majority of the described LPA actions are g-protein mediated and both, receptors and signaling pathways are present in the brain. Thus, LPA mediated actions in the brain came into focus. In this thesis the patch-clamp technique was utilized to investigate neuromodulatory actions of LPA in mouse neurons. During brain development LPA actions are described. A family of LPA degrading enzymes the lipidphosphate phosphatases (LPPs) are present early in development. Reduced levels of LPP1/1a via shRNA in the embryonic brain resulted in a slowed migration of neocortical neurons. Neurons with changed LPP1/1a levels were electrophysiological profiled, because the maturation of ionic currents is tightly coupled to the migration of neurons. Neurons reaching their target at embryonic day 18 independent of their LPP1/1a levels did not differ. However, neurons that migrated slower due to shRNA expression did not generate regenerative potentials. A probable underlying cause was the same ratio of inward and outward rectifying conductances in contrast to a higher inward ratio in controls. On postnatal day 5 these neurons were mostly in layer 5 and no longer electrophysiologically different. In conclusion, the migration deficit lead to a delayed current development and an electrophysiological re-organisation of affected neurons in the neocortex. CA1 hippocampal neurons in accute brain slices responded to LPA. When LPA was applied extracellularly miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) increased in frequency. However, the inhibtory miniature postsynaptic currents (mIPSCs) were unchanged. The mEPSC increase was mediated by LPA2-receptors as there was no increase in LPA2-receptor knock-out mice. Further investigations were carried out in primary cultured hippocampal neurons to pin-point the LPA localisation. Contrary to accute slices the in vitro model responded with a reduction of mEPSCs. Neither mIPSCs of wildtype nor mEPSCs of LPA2 knock-out neurons were changed. The most probable modulation by calcium was further investigated. Buffering postsynaptic [Ca2+]i and applying LPA reduced mEPSCs whereas no reduction was observed after omitting extracellular Ca2+. These contrary results between accute slices and cultured neurons point to an involvement of glial factors and/ or artifacts as a result of culturing. Furthermore, the hyperpolarisation activated cyclic nucleotide gated current Ih can be modulated by g-protein signaling cascades. Activation of these, therefore, could lead to Ih modulation. A putative modulation was investigated in CA1 neurons, but somatic whole-cell recordings revealed no change of Ih. These results show that LPA-receptor activation is either not specific or a modification of Ih cannot be measured. Taken together these data show that lysophosphatidic acid has transient and long lasting physiological implications in neurons. Furthermore, the conducted experiments might be the starting point for future studies.