Biochemische Modifikation von Glykan-Strukturen durch nicht natürliche Monosaccharide und ihr Einfluss auf die Sialidase-Resistenz

Abstract

Die Sialylierung von Glykokonjugaten ist essentiell für eine Vielzahl von Prozessen in und zwischen Zellen. Neben Zelldifferenzierungen, Entzündungsreaktionen, Zell-Adhäsionen und Pathogenesen ist die Beeinflussung der Stabilität von Glykoproteinen im Serum von Bedeutung. Die Abspaltung der terminalen Sialinsäuren durch Sialidasen ermöglicht die Bindung an den Asialoglykoprotein-Rezeptor und der Abbau des Glykoproteins wird eingeleitet. Durch die gezielte Modifikation einzelner Monosaccharide sollte die Aktivität der Sialidasen beeinflusst und im Vergleich zu nativen Oligosacchariden bestimmt werden. Nach der Supplementation der Zelllinien CHO (murin), sowie HEK293 und K-562 (human) mit 2-Desoxy-Galactose konnte ein konzentrationsabhängiger Austausch gegen die subterminale Galactose durch HPLC- und MS-Methoden nachgewiesen werden. Der Anteil von 62 % 2-Desoxy-D-Galactose in CHO-Zellen führte zu einer fast vollständigen Resistenz gegenüber der unspezifischen Sialidase A. In den humanen Zelllinien wurden Einbauraten zwischen 23 und 25% festgestellt. Während die K-562-Zellen im Vergleich zu nicht-modifizierten Glykanen eine 1,6fach erhöhte Sialidase- Resistenz aufwiesen, war diese in den HEK293-Zellen erniedrigt. Generell erfolgte in Anwesenheit der 2-Desoxy-D-Galactose eine reduzierte Glykosylierung. Die terminale Präsenz nicht-natürlicher Sialinsäuren in Glykanen hatte keine Änderung des Glykan-Profils zur Folge. Die an der Acetyl- Gruppe modifizierten N-Acetylmannosamine wurden entsprechend dem nativen Vorläufer zu neuen Neuraminsäuren umgesetzt und erreichten in den Glykoproteinen der Zellen einen Anteil von 45-92%. Die höchsten Sialidase C-Resistenzen in der murinen (CHO) und humanen Zelllinie (HEK293) konnten für die Analoga N-Butanoyl- und N-Pentanoylmannosamin festgestellt werden, die gleichzeitig die geringsten Einbauraten vorwiesen. Die Menge an messbaren sialylierten Strukturen nach der Enzymbehandlung erhöhte sich um das maximal 2,5fache (CHO) bzw. 1,6fache (HEK293) in Anwesenheit artifizieller Neuraminsäuren. Somit stellen beide Modifikationen, 2dGal und N-Acylmannosamine, eine Möglichkeit zur Verlängerung der Halblebenszeit von Glykoproteinen dar. Die Optimierung der Massenspektrometrie-Methodik und die Etablierung der Fragmentierung mittels Ionenfallen-Technik ermöglichte die Glykan-Charakterisierung ohne Fluoreszenz-Markierung mit HPLC-Auftrennungen. Die Auswertung der erhaltenen MS-Daten wurde mit Hilfe von online verfügbaren Programmen standardisiert. Für die Kalkulation der molekularen Massen von Glykanen, Peptiden und Glykoproteinen war der Aufbau einer Datenbank- basierenden Anwendung erforderlich. Das resultierende GlycoProtMass ermöglichte sowohl die Berechnungen von Molekülmassen, als auch deren Archivierung mit zusätzlichen Informationen.

The sialylation of glycoconjugates is important for many cellular processes in cells and cell-cell contacts. Besides cell differentiation, inflammation, cell adhesion and pathogenesis, sialic acids influence the stability of glycoproteins. If these terminal monosaccharides are cleaved by sialidases glycoproteins bind to the asialoglycoprotein receptor and are degradated. The selective modification of monosaccharides should be tested for their influences on sialidase activities in comparison to native oligosaccharides. The supplementation of CHO cells (murine) and HEK293, K-562 (both human) with 2-deoxy-d-galactose (2dGal) led to an exchange against subterminal galactose. In CHO cells the glycans of membrane proteins had 62% 2-deoxy-galactoses incorporated in a nearly complete sialidase A resistance. The human cell lines showed incorporation rates of 23-25% for 2dGal. In comparison to unmodified oligosaccharides a 1,6-fold increased resistance was determined in K-562. In the case of HEK293 glycans were more sensitive against sialidase A treatment. Generally 2dGal induced a reduction in glycosylation. The also generated non- native sialic acids did not change the glycan profiles but the behaviour of these terminal monosaccharides. N-Acetylmannoseamines with modifications in the acetyl-group were used like native precursors of sialic acids and the resulting new neuraminic acids reached incorporation rates of 45-92%. The highest sialidase C resistance was detected for N-butanoyl- and N-pentanoylmannoseamine which also have shown the lowest incorporation rates. The new artificial monosaccharides led to an 2,5-fold higher sialidase resistance for CHO and 1,6-fold higher for HEK293 respectively. Both modifications, 2dGal and N-Acylmannoseamines, are good possibilities to modify the lifetime of glycoproteins. Optimized masspectrometric methods and established fragmentation with iontrap techniques were used to characterize glycans without fluorescence labelling with HPLC separations. The Analysis of resulting data was standardised with programs which are freely available in the internet. For the calculation of molecular masses of glycans, peptides and glycoproteins a new tool GlycoProtMass was developed. This program can be used simultaneously to calculate masses of molecules and to save results with additional information.