dc.contributor.author
Böhm, Caroline
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:39:11Z
dc.date.available
2013-03-21T11:23:49.071Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8221
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12420
dc.description.abstract
Das Hepatitis-B-Virus (HBV) besteht aus einem kleinen (3,2 kb) zirkulären,
partiell doppelsträngigen DNA-Genom und verursacht akute und chronische
Hepatitiden, Leberzirrhose und hepatozelluläre Karzinome (Ganem und Varmus,
1987). In vorangegangenen Studien anderer Arbeitsgruppen konnten vermehrte
Mengen des Proteins α - Taxilin in tumorösem Gewebe von Nierenzellkarzinomen
und HCCs nachgewiesen werden (Ohtomo et al., 2010). HCCs können als Folge
einer chronischen HBV-Infektion entstehen (Lupberger und Hildt, 2007, Cougot
et al., 2005). α -Taxilin ist ein ubiquitär exprimiertes Protein mit einer
Größe von 62 kDa. Allgemein ist relativ wenig über dieses Protein bekannt. In
der vorliegenden Arbeit wurde die Interferenz von HBV mit α -Taxilin näher
untersucht. In Western-Blot- und Immunfluoreszenzuntersuchungen konnte
nachgewiesen werden, dass sich HBV steigernd auf die Expression von α -Taxilin
auswirkt. Dies konnte sowohl in stabil und transient transfizierten HBV-
replizierenden Zelllinien als auch in vivo im HBV-transgenen Mausmodell und in
Lebern HBV-infizierter Patienten nachgewiesen werden (siehe Kapitel 5.1 Abb.
5.1, Kapitel 5.2.1 Abb. 5.4, Kapitel 5.2.2 Abb. 5.9 und 5.10). Die Messung
gesamtzellulärer RNA in stabil und transient transfizierten, HBV-
replizierenden Zellen (siehe Kapitel 5.1 Abb. 5.2) sowie in humanen
Leberproben (siehe Kapitel 5.2.2 Abb. 5.11) mittels quantitativer real-time
PCR (RT-PCR) wies ebenfalls erhöhte α -Taxilin-Mengen auf. In Lebern HBV-
transgener Mäuse war jedoch eine geringere α -Taxilin-mRNA-Menge trotz höherer
Proteinmengen im Vergleich zu den Kontrollmäusen detektierbar (siehe Kapitel
5.2.1 Abb. 5.5). Hierfür könnten unterschiedliche Regulationsmechanismen des α
-Taxilin-Gens verantwortlich sein. Eine mögliche Erklärung für die
Beobachtungen im Mausmodell ist, dass α -Taxilin eine längere Halbwertszeit
hat, welche zu einer verringerten mRNA-Menge führt. Eine andere mögliche
Erklärung könnte ein negativer feedback- Mechanismus sein, welcher durch die
hohen α -Taxilin-Mengen bedingt ist und das mRNA Niveau herunterreguliert. Die
Beobachtungen erhöhter α -Taxilin-Mengen durch HBV warf die Frage auf, wie
sich eine Überexpression von α -Taxilin auf die HBV-Replikation auswirken
würde. Die Überexpression führte jedoch zu keinem signifikanten Effekt auf die
HBV-Replikation, da die α -Taxilin-Expression in HBV-replizierenden Zellen
schon so weit hochreguliert ist, dass die Replikation durch eine weitere
Überexpression unbeeinflusst bleibt (siehe Kapitel 5.3 Abb. 5.13). Im
Gegensatz dazu führte der knockdown des α -Taxilin-Gens zu einer signifikant
verminderten Anzahl freigesetzter Viren im Vergleich zu den entsprechenden
Kontrollzellen (siehe Kapitel 5.4 Abb. 5.15). Dies lässt vermuten, dass die
Inhibierung von α -Taxilin zu einer verminderten HBV-Replikation und somit zu
einer verminderten Freisetzung infektiöser Viruspartikel führt. ELISA-
Messungen der Überstände transfizierter α -Taxilin-knockdown-Zellen zeigten
erhöhte Mengen an HBs- und HBe-Ag (siehe Kapitel 5.4 Abb. 5.16). Wie bereits
beschrieben wird spekuliert, dass α -Taxilin als SM-Protein fungieren könnte
(Nogami et al., 2003, Nogami et al., 2003a). Es ist vorstellbar, dass α
-Taxilin als negativer Regulator auf die SNARE-Formation wirkt, indem es
freies Syntaxin bindet und die SNARE-Komplex-Bildung und folglich den
Vesikeltransport verhindert. Wird die Expression von α -Taxilin inhibiert,
steht ausreichend freies Syntaxin für die Bildung des SNARE-Komplexes zur
Verfügung. Somit kann der vesikuläre Transport ungestört ablaufen, was die
erhöhten Mengen HBe- und HBs-Ag im Überstand erklären könnte. Der beobachtete
Effekt der verminderten Anzahl freigesetzter Viren in α -Taxilin-knockdown
Zellen lässt jedoch vermuten, dass α -Taxilin eine wichtige Rolle im Export
viraler Partikel spielen könnte. Um dies näher zu untersuchen, wurde die
subzelluläre Lokalisation von α -Taxilin mittels Immunfluoreszuntersuchungen
näher analysiert. Hier fiel auf, dass α -Taxilin mit Core und LHBs-Ag
colokalisiert, nicht aber mit SHBs-Ag, welches Hauptbestandteil subviraler
Partikel ist (siehe Kapitel 5.5 Abb. 5.17 und 5.18). Um zu verifizieren, ob es
sich dabei um echte Interaktionen handelt, wurden Co-
Immunpräzipitationsanalysen durchgeführt. Diese bestätigten die Interaktion
von α -Taxilin mit LHBs-Ag bzw. PreS1PreS2 (siehe Kapitel 5.6 Abb. 5.19 und
Kapitel 5.7 Abb. 5.20). Dies bestätigt die Vermutung einer essentiellen Rolle
von α -Taxilin für den HBV Lebenszyklus. Es ist bekannt, dass virale und
subvirale Partikel die infizierte Zelle über unterschiedliche Mechanismen
verlassen (Lambert et al., 2007). Virale Partikel werden unter Beteiligung der
ESCRT-Maschinerie sezerniert, der Weg der subviralen Partikel ist ESCRT-
unabhängig (Lambert et al., 2007). Die genauen Mechanismen sind jedoch noch
nicht vollständig verstanden und sind Gegenstand aktueller Forschung. Bei der
Betrachtung der Proteinsequenz von α -Taxilin fielen eine Vielzahl von
prolinreichen Motiven, sogenannten PXXP-Motiven, auf. Beim humanen
Immundefizienzvirus (HIV) enthält das gag- Protein eine Vielzahl dieser late
domains (PXXP-Motive) und vermittelt so die Interaktion mit der ESCRT-
Komponente tsg101 (Garrus et al., 2001, VerPlank et al., 2001). Das ESCRT-
System ist für die Erkennung ubiquitinierter Membranproteine verantwortlich
und sortiert sie in intraluminale Vesikel (ILVs) (Hurley und Hanson, 2010).
Die entstehenden ILVs können mit dem Lysosom oder aber auch mit der
Plasmamembran fusionieren. Somit könnte das ESCRT-System einen potentiellen
Sekretionsweg viraler Partikel aus der infizierten Zelle vermitteln. In
Western-Blot-Analysen (Daten nicht gezeigt) und Immunfluoreszenzuntersuchungen
konnte gezeigt werden, dass parallel zur Expression von α -Taxilin auch die
Expression der ESCRT-Komponente tsg101 in HBV-positiven Zellen erhöht ist
(siehe Kapitel 5.8 Abb. 5.21) und dass beide Proteine colokalisieren (siehe
Kapitel 5.9 Abb. 5.23). Umgekehrt zeigte sich, dass der knockdown der α
-Taxilin-Expression eine deutliche Verminderung der tsg101-Expression zur
Folge hat (siehe Kapitel 5.8 Abb. 5.22). Die Interaktion der beiden Proteine
konnte mittels Co-Immunpräzipitationsanalyse schließlich verifiziert werden
(siehe Kapitel 5.10 Abb. 5.24). Da HBV-Strukturproteine frei von sogenanngten
late domains sind, liegt die Vermutung nahe, dass α -Taxilin eine Adapterrolle
im HBV-Lebenszyklus einnimmt, dem ESCRT-System die prolinreichen Motive
liefert und so die Bindung an tsg101 ermöglicht. Zusammenfassend konnte in
dieser Arbeit gezeigt werden, dass α -Taxilin sowohl eine Rolle in der
Replikation von HBV als auch eine Rolle in der Virusmorphogenese spielt. Die
HBV-Infektion wirkt sich steigernd auf die Expression von α -Taxilin aus, was
in mehreren Infektionsmodellen nachgewiesen werden konnte. α -Taxilin scheint
für die Replikation des Virus essentiell zu sein, da der knockdown des Gens
die Replikation hemmt. Die Interaktion von α -Taxilin mit LHBs Ag und α
-Taxilin mit der ESCRT-Komponente tsg101 konnte nachgewiesen werden und legt
eine Rolle als Adapterprotein von α -Taxilin nahe. Late domains sind für die
Interaktion von Viren mit dem ESCRT-System erforderlich (Lambert et al.,
2007). Die Sequenz von α -Taxilin weist eine Vielzahl dieser PXXP-Motive auf,
welche den HBV-Strukturproteinen fehlen. Auch die Expression der ESCRT-
Komponente tsg101 ist in HBV-replizierenden Zellen erhöht, was die Hypothese
unterstützt. In zukünftigen Experimenten könnten rescue-Experimente Aufschluss
darüber geben, ob die Replikation durch die Transfektion eines α -Taxilin-
Expressionsplasmids wiederhergestellt werden kann. Außerdem ist es von
Interesse herauszufinden, welche Stelle von α -Taxilin für die Bindung mit dem
ESCRT-System sowie mit dem Virus verantwortlich ist. Dies könnte mittels einer
Genkartierung von α -Taxilin analysiert werden. In weiteren Versuchen könnte
untersucht werden, ob α - Taxilin zusätzlich mit anderen Komponenten der
ESCRT-Maschinerie interagiert. Ist dies nicht der Fall, so könnte man die
Interaktion mit tsg101 möglicherweise hemmen und somit die Virus Sekretion
unterbinden. Würde dies gelingen, so könnte das einen möglichen Therapieansatz
darstellen, der die Verbreitung des Virus verhindern würde. Außerdem ist von
Interesse, ob α -Taxilin ein Ubiquitin-Interaktions-Motiv besitzt, welches
zusätzlich den Kontakt zur ESCRT-Maschinerie vermitteln könnte.
de
dc.description.abstract
The human hepatitis B virus (HBV) belongs to the family of hepadnaviridae
(Schädler und Hildt, 2009). It harbors a partially double-stranded DNA genome
which is about 3.2 kb in size (Schädler und Hildt, 2009). HBV is a major cause
of liver disease which can cause acute or chronic hepatitis. In addition, HBV
is considered to be a major etiological factor in the development of human
hepatocellular carcinoma (HCC) (Lupberger und Hildt, 2007, Cougot et al.,
2005). Beside the viral particles there are also so called subviral particles
(SVP) detectable in the blood of infected patients (Ganem, 1991). SVPs are
composed of SHBs-Ag, do not contain viral DNA and are therefore not
infectious. HBV itself is not cytopathologic. But the risk of HCC in HBV
infected patients is much higher than in uninfected patients (Beasley et al.,
1981). Therefore HBV plays an important role in the pathogenesis of HCC
(Beasley, 1988). Recent studies showed that α -taxilin, a newly identified
membrane traffic-related molecule, is upregulated in malignant tissues of HCCs
(Ohtomo et al., 2010), which can be the consequence of a chronic HBV
infection. α -taxilin is a ubiquitinously expressed protein of 62 kDa. There
is not much known about the function of this protein. Therefore in this study
the interference between HBV and α -taxilin should be investigated in more
detail. Western blot analysis and immunofluorescence staining revealed higher
α -taxilin amounts in stable HBV-expressing and transiently transfected cells.
This investigation could be confirmed in in vivo models, such as HBV-
transgenic mice and livers of HBV infected patients (see chapter 5.1 fig. 5.1,
chapter 5.2.1 fig. 5.4, chapter 5.2.2 fig. 5.9 and 5.10). In contrast to the
finding of high α -taxilin mRNA levels in HBV-replicating cells (see chapter
5.1 fig. 5.2) and in human liver samples (see chapter 5.2.2 fig. 5.11), the α
-taxilin mRNA levels in HBV-transgenic mice were lower compared to the control
(see chapter 5.2.1 fig. 5.5). A possible explanation to this finding could be
a different regulation mechanism of α -taxilin in humans and mice. A long half
life of the protein α -taxilin in mice which causes the lower amounts of mRNA,
could be possible. A different explanation could be a negative feedback
mechanism caused by the high α -taxilin amounts in order to downregulate the
mRNA levels. Based on the higher α -taxilin amounts in several HBV infection
models, we wanted to know if an overexpression of α -taxilin would influence
the HBV replication. However, overexpression of α -taxilin showed no
significant effect on the HBV replication (see chapter 5.3 fig. 5.13). The α
-taxilin amounts are so high that a moderate overexpression has presumably no
effect. In contrast to the overexpression, inhibition of α -taxilin by siRNA
abolishes HBV replication almost completely (see chapter 5.4 fig. 5.15). This
supports the hyopthesis that α -taxilin plays an important role in HBV
replication. But not only the viral replication is massively regulated by α
-taxilin, but also the release of viral paticles. ELISA measurements of
supernatants of α -taxilin knockdown cells revealed higher amounts of HBs- and
HBe-antigen (see chapter 5.4 fig. 5.16). As already described, it is
speculated that α -taxilin acts as a SM-protein by binding free syntaxin and
therefore prevents the SNARE complex formation and the vesicle transport
(Nogami et al., 2003, Nogami et al., 2003a). When the expression of α -taxilin
is inhibited, the syntaxins are available for SNARE complex formation and
therefore the vesicular transport can take place which explains the elevated
levels of HBe- and HBs-antigen in the supernatant. In order to get more
information about the subcellular distribution of α -taxilin, we performed
immunofluorescence staining. It was found that α -taxilin colocalizes with
core and LHBs-antigen, but not with SHBs-antigen, which is the main
constituent of SVPs (see chapter 5.5 fig. 5.17 and 5.18). To verify if this
colocalization is due to an interaction or not, we performed co-
immunoprecipitation. These data confirm the interaction between α -taxilin and
LHBs-Ag and PreS1PreS2, respectively (see chapter 5.6 fig. 5.19 and chapter
5.7 fig. 5.20), which confirms our assumption of an essential role of α
-taxilin for the HBV lifecycle. Recent work provides evidence that viral
particles leave the cell by a pathway that is different from the pathway used
by SVPs (Lambert et al., 2007). Although HBV is an enveloped DNA virus, there
is evidence that maturation and egress of HBV depends on intraluminal vesicles
(ILV) of maturing endosomes – the multivesicular bodies (MVB) (Patient et al.,
2009, Lambert et al., 2007, Watanabe et al., 2007). It could be shown that HBV
assembly and egress were potently blocked by perturbing the MVB machinery. The
release of subviral particles was not affected by MVB inhibitors (Lambert et
al., 2007). However, efficient release of enveloped viruses using the ESCRT
system requires the presence of viral late domains including PXXP motives
(Hurley und Hanson, 2010, Lambert et al., 2007). For HIV it could be shown
that the structural gag protein binds to tsg101 (a component of the ESCRT-I
complex) via its PXXP motives (Garrus et al., 2001, VerPlank et al., 2001).
The sequence of α -taxilin harbors a variety of such PXXP motives, which are
found in the N-terminal domain and clustered in the C-terminal part of the
protein. Therefore the ESCRT system could represent a potential secretion
pathway for HBV viral particles. In order to analyze the influence of HBV on
the ESCRT system, western blot analysis and immunofluorescence stainings were
performed. Western blot (data not shown) and immunofluorescence analysis could
show that the expression of the ESCRT-component tsg101 is upregulated in HBV-
positive cells in parallel to the higher α -taxilin amounts (see chapter 5.8
fig. 5.21). In chapter 5.9 fig. 5.23 a partial colocalization of both proteins
can be seen. Vice versa, inhibition of α -taxilin expression results in
decreased levels of intracellular tsg101 (see chapter 5.8 fig. 5.22). In co-
immunoprecipitation experiments we could prove an interaction between α
-taxilin and tsg101 (see chapter 5.10 fig. 5.24). Taken together, these
results indicate that α -taxilin plays an essential role in HBV replication,
as well as an important role in the morphogenesis of HBV. HBV infection has an
enhancing effect on the α -taxilin expression, which could be shown in several
infection models. The important role of α -taxilin could be proved by
inhibition of α -taxilin which abolished HBV replication almost completely.
The interaction of α -taxilin with the viral structural protein LHBs on one
side and the interaction of α -taxilin with the ESCRT system on the other side
makes it very likely that α -taxilin serves as an adaptor protein. Because HBV
structural proteins lack the late domains which are essential for the binding
to the ESCRT system we conclude that α -taxilin serves as an adaptor protein
binding LHBs-Ag and provides the PXXP motives which are essential for the
binding to the ESCRT system. In future experiments, it could be investigated
whether α -taxilin also interacts with other components of the ESCRT
machinery. If this is not the case, one could inhibit the interaction with
tsg101 and thus prevent the virus secretion. If this would succeed, it could
be a potential therapeutic approach that would prevent the spread of the
virus. Previously, the functional binding sites of α -taxilin which are
responsible for for the binding to the ESCRT machinery and the virus must be
identified. This could be analyzed by means of a genetic mapping of α
-taxilin. Moreover, it would be interesting to see whether α -taxilin harbors
a ubiquitin interaction motif which also provides contact to the ESCRT
machinery. In further experiments, rescue experiments could shed light on
whether the HBV replication can be recovered by the transfection of an α
-taxilin expression plasmid.
en
dc.format.extent
III, 92 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Hepatitis B virus
dc.subject
hepatocellular carcinoma
dc.subject
Hepadnaviridae
dc.subject
liver cirrhosis
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft
dc.title
Charakterisierung der Bedeutung von α-Taxilin für den Lebenszyklus des
Hepatitis-B-Virus
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Ralf Einspanier
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Eberhard Hildt
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Benedikt Kaufer
dc.date.accepted
2013-01-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000093817-3
dc.title.translated
Characterization of the importance of α-taxilin for the life cycle of the
hepatitis B virus
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000093817
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Mensch und Buch Verlag
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