Genetically altered animal models to study tissue actions of angiotensin peptides

Abstract

The main interest of this thesis is the renin-angiotensin system, which is composed of 2 major arms: a vasoconstrictor/proliferative mediator Ang II, and a vasodilator/anti-proliferative effector Ang (1-7) receptor GPCR Mas. A heterogeneous genetic background limited earlier studies of Mas-deficient mice, which resulted in no clear-cut cardiovascular phenotype. We backcrossed Mas-gene deleted mice onto an FVB/N and Bl/6 background over 7 generations and found that only FVB/N Mas-deficient mice exhibit higher blood pressures, compared to controls. Both lines of Mas-deficient mice also had impaired endothelial function, decreased nitric oxide production, and lower endothelial nitric oxide synthase expression. NAD(P)H oxidase catalytic subunit gp91phox protein content was higher in Mas-deficient mice than in controls, moreover superoxide dismutase and catalase activities were reduced in FVB/N Mas- deficient mice. The superoxide dismutase mimetic, tempol, decreased blood pressure in FVB/N Mas-deficient mice. Taken together, our results show a major cardiovascular phenotype in Mas-deficient mice on a homogeneous FVB/N background. We conclude that enhanced O2.- generation and decreased antioxidant activities and NO levels in the vasculature lead to endothelial dysfunction and increased blood pressure in these animals. Since Mas seems to counteract many cardiovascular effects of Ang II, this receptor is a potential target for the development of novel cardioprotective or anti-hypertensive agents. Additionally we found many differential phenotypes between FVB/N and Bl/6 mice. Bl/6 mice exhibited higher endogenous NO levels and oxidant state and less antioxidant activity than FVB/N mice. As a consequence, FVB/N mice inclined to have higher blood pressure accompanied by higher renin activity and lower NO levels. Therefore, the genetic background influences the phenotype of genetically modified animals. Genetic deletion of Mas impaired heart function of Mas-knockout mice. To analyze the involved genes, we performed Affymetrix gene expression profiling. Among 12488 transcripts, 87 genes were significantly downregulated and 182 genes were upregulated in Mas- deficient mice including Rgs2 and ADAM19, both involved in the regulation of vascular tone. Since Mas is highly expressed in testis, Affymetrix gene expression profiling was also performed with testes of Mas-deficient mice. In the testes of Bl6 Mas-knockout mice 65 genes were upregulated and 67 genes were downregulated including StAR and 3ß-HSDs involved in the regulation of steroidogenesis. Ang II plays a key role in the etiology of cardiovascular diseases. Thus transgenic mice with the rat angiotensinogen gene were investigated for the impact of Ang II on end organ damage. The aim of our study was to characterize the already generated transgenic line TGM L102. The transgenic mice had a significantly elevated blood pressure compared with control mice. The rise in blood pressure was paralleled by cardiac hypertrophy and raised concentrations of BNP. Concomitantly, fibrosis in the heart, lung, and kidney of the transgenic mice was more pronounced than in the wild type, and collagen III mRNA expression was increased. However, apoptosis was not detected in the heart. The last part of the work was intended to better understand the function of Ang II in the brain. The AVP promoter drove Ang II peptide secretion in newly generated transgenic rats, but the foreign gene was very lowly expressed. Even after stimulation by dehydration or high salt diet, there was neither an increased expression of the transgene, nor an increase in blood pressure. The main reason could be a low copy number of transgene integration.

Das Hauptinteresse der vorliegenden Arbeit gilt dem Renin-Angiotensin System und seinen zwei Hauptkomponenten, dem vasokonstriktorisch-/proliferatorativen Mediator Ang II und dem vasodilatorisch/anti-proliferativen Effektor Ang (1-7) mit seinem Rezeptor Mas. Bedingt durch einen heterogenen genetischen Hintergrund, konnte in bisherigen Studien Mas-defizienten Mäusen kein eindeutiger kardiovaskulärer Phenotyp zugeordnet werden. Durch Rückkreuzungen dieser Mäuse über 7 Generationen, auf einen FVB/N und B1/6 Hintergrund, fanden wir heraus, dass ausschließlich die FVB/N Mas-defizienten Mäuse höhere Blutdruckwerte als die Wildtypen aufwiesen. Darüber hinaus zeigten beide Mas- defizienten Mauslinien eine beeinträchtigte Endothelfunktion, eine verminderte NO-Produktion sowie eine geringere endotheliale NO-Synthase Expression. Der Gehalt der katalytischen Untereinheit der NAD(P)H Oxidase gp91phox war in den Mas-defizienten Mäusen höher als in den Kontrolltieren. Außerdem waren in FVB/N Mas-defizienten Mäusen die Aktivitäten der Superoxiddismutase und der Katalase reduziert. Das SOD-Mimetikum Tempol zeigte eine stärkere Blutdruck- senkende Wirkung in den FVB/N Mas-defizienten Tieren als in Kontrolltieren. Unsere Ergebnisse zeigen also einen deutlichen kardiovaskulären Phenotypen in Mas-defizienten Mäusen auf einem homogenen FVB/N Hintergrund. Wir nehmen an, dass die erhöhte O2.- Bildung, die verringerte antioxidative Aktivität, sowie geringere NO-Konzentrationen im Gefäßsystem endotheliale Dysfunktion und damit erhöhten Blutdruck in diesen Tieren hervorrufen. Da Mas vielen kardiovaskulären Effekten von Ang II entgegenzuwirken scheint, ist dieser Rezeptor ein potentielles Target für die Entwicklung neuer kardioprotektiver und anti-hypertensiver Wirkstoffe. Außerdem fanden wir zwischen FVB/N und B1/6 Mäusen viele Unterschiede. B1/6 Mäuse wiesen höhere NO-Werte und mehr oxidativen Stress sowie geringere antioxidative Aktivität auf als FVB/N Mäuse. Dementsprechend tendierten FVB/N Mäuse zu höheren Blutdruckwerten, begleitet von höherer Renin-Aktivität und geringeren NO-Werten. Folglich beeinflußt der genetische Hintergrund den Phänotypen von genetisch modifizierten Tieren. Das genetische Ausschalten von Mas beeinträchtigte die Herzfunktion von Mäusen. Zur Analyse der entsprechenden genetischen Prozesse haben wir ein Affymetrix Genexpressions-Profil erstellt. Unter 12488 Transkripten, waren 87 Gene in Mas-defizienten Mäuse signifikant herunterreguliert, z.B. Rgs2 und ADAM19, welche beide an der Regulierung des Gefäßtonus beteiligt sind. 182 Gene waren dagegen hochreguliert. Da Mas stark im Hoden exprimiert wird, wurden Affymetrix Genexpressions-Profile auch für Hoden von Mas-defizienten Mäusen erstellt. In den Hoden der B1/6 Mas-knockout Mäuse waren 65 Gene hochreguliert und 67 Gene herunterreguliert, einschließlich der in die Steroidogenese involvierten Faktoren StAR und 3β-HSDs. Ang II spielt eine Schlüsselrolle in der Ätiologie von kardiovaskulären Erkrankungen. Deshalb wurden transgene Mäuse, die das Ratten-Angiotensinogen überexprimieren, auf den Einfluss von Ang II auf Endorganschäden untersucht. Das Ziel unserer Studie war die Charakterisierung der bereits generierten transgenen Linie TGM L102. Die transgenen Mäuse hatten, verglichen mit den Kontrollmäusen, einen signifikant höheren Blutdruck. Der Anstieg des Blutdrucks korrelierte mit Herz- Hypertrophie und erhöhten Konzentrationen von BNP. Begleitend dazu waren Fibrose in Herz, Lunge und Nieren der transgenen Mäuse mehr ausgeprägt als im Wildtyp. Außerdem war die Kollagen III mRNA-Expression erhöht. Allerdings konnte im Herz keine Apoptose detektiert werden. Der letzte Abschnitt der Arbeit zielte auf ein besseres Verständnis der Funktion von Ang II im Gehirn ab. Für die Kontrolle der transgenen Ang II Freisetzung wurde der Promotor für AVP in transgenen Ratten verwendet. Allerdings zeigte dieser nur eine sehr geringe Expressionsrate. Selbst nach einer Stimulation durch Dehydrierung oder einer Hochsalz-Diät war weder eine erhöhte Expression des Transgens noch eine Blutdrucksteigerung festzustellen. Hauptursache für dieses Problem könnte die geringe Anzahl ins Genom integrierter Transgen-Kopien sein.