Granulozyten tragen zur Schmerzkontrolle, nicht jedoch zur Schmerzentstehung in entzündetem Gewebe bei

Abstract

In der vorliegenden Studie wurde der Einfluss von Granulozyten auf die Hyperalgesie am Modell der FCA-induzierten Entzündung der Rattenhinterpfote untersucht. Sämtliche Untersuchungen beziehen sich auf frühe Zeitpunkte (2 h nach FCA-Injektion), da zu diesem Zeitpunkt Granulozyten als quantitativ größte Leukozytenpopulation in das entzündete Gewebe migrieren. Um den Zusammenhang zwischen der Anzahl der im entzündeten Gewebe vorhandenen Granulozyten und der zeitgleich auftretenden Hyperalgesie genauer untersuchen zu können, wurde die Zahl der Granulozyten im Gewebe variiert. Dazu wurde ein Chemokin benutzt, das speziell Granulozyten rekrutiert, sowie ein Antiserum, das Granulozyten gezielt signifikant reduziert. Granulozyten werden über eine Signalkaskade von Adhäsionmolekülen zur Transmigration durch das Endothel des entzündeten Gewebes angeregt. Die Chemokine KC, MIP-2, CINC-2 und LIX spielen dabei eine wichtige Rolle. Granulozyten migrieren entlang eines Konzentrationsgradienten in Richtung der höchsten Chemokinkonzentration. Die Granulozytenrekrutierung mittels Chemokinen erfolgt bei Ratten ausschließlich über den CXCR2-Rezeptor, an den die vier CXCR2-Liganden KC, MIP-2, CINC-2 und LIX binden. Im ersten Schritt wurde die Chemokin-mRNA-Expression von KC, MIP-2, CINC-2 und LIX nach FCA-Injektion in die Rattenpfote zu frühen Entzündungszeitpunkten gemessen. Dabei zeigte sich, dass die mRNA-Produktion mit Ausnahme von KC zu frühen Zeitpunkten (≤ 2 h nach FCA) noch gering ist und erst im späteren Entzündungsverlauf (12 h nach FCA) deutlich ansteigt. Zum Zeitpunkt 2 h erscheint eine Steigerung der Granulozytenmigration durch zusätzliche Chemokin-Injektion möglich. Da alle vier Chemokine die Granulozyten über denselben Rezeptor (CXCR2) selektiv und spezifisch rekrutieren und Studien nachweisen, dass MIP-2 hinsichtlich der Granulozytenrekrutierung wirksamer ist als KC, wurde für die weiteren Untersuchungen das Chemokin MIP-2 ausgewählt. In vitro wurde die Migration von Granulozyten durch MIP-2 spezifisch induziert. Die höchste Migration wurde mit einer MIP-2-Konzentration von 10-8 M erreicht, bei höheren Konzentrationen fiel der Migrationsindex ab. Versuche anderer Arbeitsgruppen in vivo zeigen, dass bei höheren Chemokin-Konzentrationen eine Rezeptorinternalisierung bzw. Rezeptorherunterregulation stattfindet, so dass noch höhere Chemokindosen auf Grund der limitierten Anzahl an Rezeptoren vermutlich keine stärkere Migration erzielen können. Im nächsten Schritt wurde in vivo gezeigt, dass zum Zeitpunkt 2 h eine selektive und effiziente Granulozytenrekrutierung durch MIP-2 möglich ist, sowohl in Kombination mit, als auch ohne eine FCA-Injektion. Andere Zellpopulationen, wie z.B. Monozyten/Makrophagen, die die Hyperalgesie möglicherweise zusätzlich beeinflussen, wurden nicht signifikant verändert. Mittels eines anti-PMN Serums wurden die Granulozyten in der Pfote selektiv signifikant reduziert. 2 h nach FCA-Injektion waren bei granulozytendepletierten Ratten nur noch 10 % Granulozyten in der Pfote vorhanden, während sich die Zahlen anderer Zellen, wie z.B. der Monozyten/Makrophagen nicht signifikant veränderten. Der Einfluss der Granulozytenzahl auf die Hyperalgesie liess sich so näher quantifizieren: die FCA-induzierte Entzündung führte zu einer von der Anzahl der Granulozyten weitgehend unabhängigen thermalen Hyperalgesie. In der FCA entzündeten Rattenhinterpfote stand offensichtlich der Entzündungsstimulus durch FCA im Vordergrund. Weder die Steigerung der Granulozytenanzahl noch die signifikante Reduktion der Granulozyten bewirkte Veränderungen der thermalen Hyperalgesie. Zudem zeigte sich, dass die alleinige MIP-2-Injektion zwar die Granulozytenanzahl in der Rattenpfote selektiv erhöhte, dass dies jedoch keine thermale Hyperalgesie bewirkte. Um die Ergebnisse der Verhaltensexperimente zu unterstützen, wurde die c-fos-mRNA-Expression im ipsilateralen Hinterhorn des korrespondierenden Rückenmarkanteiles gemessen. Dieser Ansatz basiert auf den Ergebnissen verschiedener Studien, in denen die Höhe der Expression von c-Fos- Protein mit der Intensität eines peripher einwirkenden schmerzhaften Stimulus positiv korrelierte. Dabei war die Höhe der c-Fos Proteinexpression direkt von der Intensität des schmerzhaften Reizes abhängig. Die Ergebnisse der Messung der c-fos-mRNA-Produktion im Rückenmark bestätigten die Ergebnisse der thermalen Hyperalgesie: (1) Weder die verstärkte Granulozyteneinwanderung noch die Depletion bewirkten Veränderungen der c-fos-mRNA-Produktion verglichen mit der alleinigen FCA-Injektion. (2) Die alleinige MIP-2-Injektion führte zur signifkanten Granulozyteneinwanderung, aber in Übereinstimmung mit den Verhaltensexperimenten zu keiner erhöhten c-fos-mRNA-Produktion.

In the available study the influence of granulocytes on hyperalgesia was examined in a model of FCA induced inflammation of the rat hind paw. All investigations refer to early times (2 h after FCA-injection), since at this point in time granulocytes represent the main leucocyte subpopulation immigrating into the inflamed hind paw. In order to examine the correlation between the number of granulocytes detectable in the inflamed tissue and the simultaneously occurring hyperalgesia, the number of granulocytes in the examined tissue was varied. To achieve this variation a chemokine, particularly recruiting granulocytes, as well as an anti-serum selectively depleting granulocytes was used. Transmigration of granulocytes through the endothelium into the inflamed tissue is stimulated by a cascade of signals via adhesionmolecules. In this transmigration process the chemokines KC, MIP-2, CINC-2 and LIX play an important role. Granulocytes migrate along a concentration gradient toward the highest chemokine concentration. The recruitment of granulocytes in response to chemokines occurs in rats exclusively via the CXCR2-receptor, a selective receptor for the four CXCR2-ligands KC, MIP-2, CINC-2 and LIX. In a first step the chemokine mRNA expression of KC, MIP-2, CINC-2 and LIX was measured at early points of infammation after FCA-injection into the rat paw. It became apparent that mRNA production with exception of KC is still small at early time points (£ 2 h after FCA), clearly rising during the progression of the inflammation (12 h after FCA). 2 h after injection an increase in the granulocyte recruitment in response to chemokine-injection seems to be possible. Since all four chemokines recruit granulocytes selectively and specifically via the same receptor (CXCR2) and since studies show that recruitment in response to MIP-2 is more effective than recruitment in response to KC, the chemokine MIP-2 was chosen for all further experiments. In vitro the migration of granulocytes was induced specifically by MIP-2. The highest migration-rate was achieved with a MIP-2-concentration of 10-8 M, at higher concentrations the migration index dropped. Experiments of other teams show that in vivo higher chemokine concentrations lead to a receptor-internalisation or receptor down-regulation, so that even higher doses of chemokines are unlikely to result in a hightened migration due to the limited number of receptors. In a next step it was shown in vivo that it is possible to recruit granulocytes selectively and efficiently in response to MIP-2 at the point in time 2 h. This was shown both in combination with FCA as well as without FCA-injection. Other cell populations, e.g. monocytes/macrophages, which may influence hyperalgesia, didn t vary significantly. By means of an anti-PMN-serum, the granulocytes in the paw were selectively significantly reduced. In granulocyte depleted rats only 10 % of granulocytes were detectable in the paw 2 h after of FCA- injection, whereas the number of other cells, e.g. monocytes/macrophages did not change significantly. The influence of the number of granulocytes on hyperalgesia was quantified in the following way: the FCA-induced inflammation caused a hyperalgesia, relatively independent to the number of available granulocytes. Obviously the stimulus of inflammation in the FCA-inflamed rat hind paw played a more prominent role than variations in the number of immigrating granulocytes. Neither the increase in the number of granulocytes nor the significant granulocyte reduction in the rat paw led to a change in thermal hyperalgesia. Furthermore it appeared that the exclusive MIP-2-injection caused a selective increase in the number of granulocytes in the rat paw, but had no effect on thermal hyperalgesia. In order to emphasize the results of the behavioral experiments, the c-fos-mRNA-expression in the ipsilateral dorsal root of the corresponding spinal cord was measured. This idea is based on the results of different studies, in which the level of the expression of c-Fos-protein shows a positive correlation to the intensitiy of a peripheral painful stimulus. In these studies the level of the c-Fos protein-expression correlated directly with the intensitiy of the painful stimulus. The results of the measurement of the c-fos-mRNA-production in the spinal cord confirmed the results of the thermal hyperalgesia: (1) neither the enhanced recruitment of granulocytes nor the depletion caused changes in the c -fos-mRNA-production compared to exclusive FCA-injection. (2) the exclusive MIP-2-Injektion caused a signifcant granulocyte recruitment, but according to the behavioral experiments no elevated c-fos-mRNA-production.