dc.contributor.author
Schaefer, Olaf
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:33:21Z
dc.date.available
2001-01-16T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8081
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12280
dc.description
Inhaltsverzeichnis 1
1 Einführung 5
1.1 Zellen reagieren spezifisch auf Signale aus ihrer Umgebung 5
1.2 Die Proteinkinase C Familie 6
1.3 Entwicklung und Differenzierung von 32D Zellen 15
1.4 Die Untersuchung differentieller Genexpression mit DNA Arrays 18
2 Zielsetzung der Arbeit 25
3 Material 24
4 Methoden 29
4.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 29
4.2 Proteinchemische Methoden 31
4.3 Molekularbiologische Methoden 37
4.4 cDNA-Array 49
4.5 TaqMan-Analyse 54
5 Ergebnisse 60
5.1 Überprüfung von DAP1, Diff6, PDI und TCTP auf ihre Phosphorylierbarkeit
durch PKC 60
5.2 Proteinkinase C regulierte Genexpression 67
6 Diskussion 89
6.1 DAP1, Diff6, TCTP und PDI sind keine PKC-Substrate 89
6.2 PKCe in 32D Zellen 90
6.3 Erhöhte TCTP-Expression in 32D PKCd- und 32D PKCe-Zellen 91
6.4 PKC-vermittelte Expression von Adhäsionsmolekülen 93
6.5 PKC-vermittelte Reduktion der Lipocortin 1-Expression 93
6.6 PKC-vermittelte Steigerung der MAPKAPK2-Expression 95
6.7 Veränderungen im Transkriptom von 32D Zellen durch die Überexpression von
PKC 98
6.8 Möglichkeiten der Expressionsanalyse mit cDNA-Arrays 99
7 Zusammenfassung 102
8 Abstract 103
9 Literaturverzeichnis 104
10 Abkürzungsverzeichnis 119
11 Abbildungsverzeichnis 123
12 Lebenslauf und Veröffentlichungen 125
13 Danksagungen 126
dc.description.abstract
Die Enzyme der Proteinkinase C Familie bilden eine Gruppe von Serin/Threonin-
Kinasen. Sie erfüllen wichtige Aufgaben in der Signaltransduktion bei
Zellwachstum, Differenzierung, Immunreaktion und Cancerogenese. Für die
Aufklärung ihrer Funktion ist es gleichermaßen wichtig, die einzelnen PKC-
Substrate zu identifizieren und die Auswirkung einer PKC-Aktivierung auf
zellulärer Ebene zu analysieren.
Die Proteine DAP1, Diff6, TCTP und das PDI-Homologe werden in vivo nach einer
Stimulierung mit dem PKC-Aktivator Phorbolester phosphoryliert. Im ersten Teil
dieser Arbeit wurde deshalb untersucht, ob diese Proteine PKC-Substrate sind.
Während PDI bereits als aufgereinigtes GST-Fusionsprotein vorlag, waren für
die anderen potentiellen PKC-Substrate weder aufgereinigtes Protein noch die
cDNAs zugänglich. Diese cDNAs wurden daher zunächst aus Maus 32D Zellen
kloniert und in GST-Expressionsplasmide überführt. Nach ihrer Expression und
Reinigung wurden alle Proteine in in vitro Kinasereaktionen mit PKCd und PKCe
sowie, in Erweiterung der Aufgabenstellung, mit PKCa eingesetzt. Dabei wurde
gezeigt, dass die o.g. Proteine keine Substrate dieser PKCs sind, sondern
wahrscheinlich Substrate tiefer stehender Kinasen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die nachgelagerten Effekte der PKC-
Aktivierung in den promyeloiden 32D Zellen betrachtet. Hierzu wurden die PKC-
abhängigen Veränderungen im Transkriptom der Zellen untersucht.
Dabei wurde zunächst eine negative Regulation der PKCe-Expression in 32D
Zellen durch PKCd festgestellt. Für das tumorassoziierte Protein TCTP trat
daneben eine deutliche Steigerung der mRNA-Expression sowohl in den 32D PKCd-
als auch in den 32D PKCe-Zellen auf. Weiterhin wurde die mRNA für das
antiinflammatorische Protein Lipocortin 1 in 32D Zellen durch PKCd und PKCe
stark herunterreguliert. Bei der Untersuchung verschiedener Mitglieder der MAP
Kinase Kaskade zeigte sich dagegen eine PKC-abhängige Erhöhung der mRNA-
Expression für MAPKAPK2.
Durch die Depletion von Lipocortin 1 kann es dabei zu einer dauerhaften
Aktivierung des MAPK/ERK Wegs und zur Steigerung entzündlicher Reaktionen
kommen. Die PKC-vermittelte Expressionssteigerung von MAPKAPK2 zusammen mit
ihrer gleichzeitigen Aktivierung könnte dabei zur Einleitung von
Differenzierung und Immunreaktion in den 32D Zellen beitragen.
de
dc.description.abstract
Protein kinase C forms a group of Serine/Threonine kinases. The members of
this family execute important tasks in the signal transduction in growth,
differentiation, immune response and cancer. To properly asses their functions
it is important to look at both, the PKC substrates and the impact of PKC
activation on the intra cellular environment.
The first part of this work elucidated the role of the potential PKC
substrates DAP1, Diff6, PDI and TCTP. In vivo all of them are phosphorylated
after stimulation with the PKC activator phorbol ester.
While GST-PDI was available as a purified fusion protein, neither protein nor
cDNA was available of the other proteins. So the cDNA of DAP1, Diff6 and TCTP
was cloned out of mouse 32D cells and subcloned into expression plasmids
containing the gene for GST. After expression and purification, all of the
proteins were used in in vitro kinase assays. Here, all of them proved not to
be substrates of PKCd, PKCe or PKCa. On the contrary these proteins are
probably subtrates for other kinases downstream of PKC.
The second part dealt with the downstream effects of the PKC activation in
promyelocytic mouse 32D cells. Here changes in the transkriptom of the cells
were analyzed on a global basis.
First PKCd was shown to downregulate PKCe in the 32D PKCd cells. The mRNA for
the translational regulated tumor protein TCTP on the other side was
upregulated in both, 32D PKCd and 32D PKCe cells. In cDNA-Array studies other
PKC regulated mRNAs were identified and proved by quantitative RT-PCR,
consequently. The mRNA for the anti inflammatory protein Lipocortin 1 was
downregulated by PKCd and PKCe. Of several members of the MAP kinase pathway,
one, the mRNA of MAPKAPK2 was shown to be upregulated by the tested PKCs.
The depletion of Lipocortin 1 could lead to a continually activated MAPK/ERK
signaling and increased inflammation. Therefore the PKC dependent upregulation
of MAPKAPK2 and it?s simultaneous activation might develop a synergistic
effect. This could be a step towards the coordinated induction of
differentiation and immune response in the 32D cells.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
PKC 32D signal transduction
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Proteinkinase C in der Signaltransduktion promyeloider 32D Zellen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Brigitte Wittmann-Liebold
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Ferdinand Hucho
dc.date.accepted
2001-01-15
dc.date.embargoEnd
2001-01-17
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2001000058
dc.title.translated
Proteinkinase C in the signaltransduktion of promyeloide 32D cells
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000000350
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2001/5/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000350
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