Direct labeling rolling circle amplification for straightforward signal increase in biodetection formats based on fluorescence spectroscopy studies

Abstract

The goal of this work was to develop a direct labeling rolling circle amplification (RCA)-based detection protocol as a straightforward and preferable general amplification strategy applicable to various detection platforms. To this end an alternative fluorophore label to Cy3, the most commonly used green excitation dye in biodetection formats, were sought. The most suitable dye, DY-555, was employed in microarray assays yielding a protocol that reduces handling and reaction time efficiently with lesser costs while providing a great signal yield. Seven fluorophores from different dye classes were investigated with steady-state and time-resolved spectroscopy to identify a candidate yielding maximum fluorescence with a minimum amount of dye molecules in a DNA template with defined labeling site spacing for the enzymatic integration of the dye-dUTPs. The most favorable properties were: High fluorescence quantum yield, absorption/emission features with a minimum sensitivity to the dye's microenvironment, and good photochemical stability. For future for multiplexed real-time detection a fluorescence lifetime well above the signal for the scattered excitation light for potential detection with time-resolved fluorescence would be favorable. DY-555 offered all of these properties along with lesser cost than Cy3 and was subsequently chosen as the fluorophore label for assay studies. An enzymatic direct labeling protocol for RCA-based signal amplification on a DNA microarray via dye-dUTPs was established. Next to the fluorophores, the labeling strategy, composition of reaction solution, and number of handling steps where optimized. With the resulting protocol, the assay's runtime and handling steps could be reduced while increasing the signal yield. The procedure was also carried out on an antibody microarray portraying the feasibility of applying this protocol to other RCA-based platforms. These features are very attractive for many detection formats but especially for point-of-care diagnostic kits that need to be easy enough to be performed by scientifically untrained personnel.

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines rolling circle amplification (RCA) basierten Nachweisprotokolls als einfache und auf verschiedene Untersuchungsplattformen anwendbare Signalamplifikationsstrategie. Für dieses Ziel wurden Alternativen zum Fluoreszenzlabel Cy3 gesucht, dem am häufigsten verwendeten Farbstoff im grünen Anregungsbereich. Der am Besten geeignete Farbstoff, DY-555, wurde in Mikroarray-Assays verwendet und führte zu einem Protokoll das die Handhabungs- und Reaktionszeit ökonomisch verringert während das Nachweissignal verstärkt wurde. Sieben Fluorophore verschiedener Farbstoffklassen wurden mit statischer und zeitaufgelöster Spektroskopie untersucht um einen Kandidaten zu finden der die maximale Fluoreszenz mit der minimalen Menge an Farbstoffmolekülen, in einem DNA Templat mit definierten Einbaustellen für die enzymatische Integration von Farbstoff-dUTPs, ermöglicht. Die günstigsten Eigenschaften waren: hohe Quantenausbeute, Absorptions-/ und Emissions-Eigenschaften die in verschiedenen Mikroumgebungen stabil sind und gute photochemische Stabilität. Für zukünftige Multiplex- Echtzeit-Detektion wäre eine möglichst lange Fluoreszenzlebenszeit, oberhalb des Signals des Anregungsstreulichts, für zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen von Vorteil. DY-555 zeigte alle diese Eigenschaften zusammen mit geringeren Kosten als Cy3 und war daher für Fluoreszenzlabel-Assaystudien ausgewählt. Ein enzymatisches Direktmarkierungsprotokoll für RCA-basierte Signalamplifikation auf DNA-Mikroarrays mittels Farbstoff-dUTPs wurde erstellt. Neben den Fluorophoren wurde die Markierungsstrategie, Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Anzahl der Handhabungsschritte optimiert. Mit dem resultierenden Protokoll konnten die Assay-Laufzeit und die Handhabungsschritte reduziert werden während das Signal verstärkt wurde. Die Prozedur wurde auch auf einem Antikörper-Mikroarray durchführt, um die Möglichkeit zu zeigen, dieses Protokoll auf anderen RCA-basierten Plattformen anzuwenden. Diese Eigenschaften machen es sehr attraktiv für viele Detektionsformate aber besonders für Vor-Ort-Diagnostikverfahren die einfach genug sein müssen um von wissenschaftlich ungeschulten Personal durchgeführt zu werden.