Calciumkanalmodulatoren vom Dihydropyridin-Typ erhöhen die endotheliale NO- Bildung: Entwicklung einer sensitiven Methode zur Nitrit-Bestimmung

Abstract

Die meisten der vorhandenen Nachweismethoden für NO sind nicht sensitiv genug, um die am Gefäßendothel stattfindende permanente, basale NO-Bildung zu messen. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit ein Verfahren entwickelt und etabliert, welches sensibel genug ist, die basale NO-Bildung zu erfassen. Die kurze Halbwertszeit von NO führt nach der endothelialen Bildung direkt zu einer stöchiometrischen Umwandlung zu Nitrit und in einem weiteren oxidativen Schritt (stöchiometrisch) zu Nitrat, so dass in einem Inkubationsansatz Nitrit und Nitrat kumulieren können. Die Konzentration an freiem NO bleibt dabei praktisch unterhalb der Nachweisgrenze. Mittels Nitrat-Reduktase wird Nitrat zurückgeführt zu Nitrit, welches in einer sauren Jodid-Messlösung zu NO reduziert und elektrochemisch mit der ISO-NO-Elektrode gemessen wird. Aufgrund der Stöchiometrie der Reaktionen geht kein NO verloren, so dass eine kumulative Messung des gebildeten Nitrats/Nitrits auf die gebildete NO-Menge schließen lässt.

Es wurde gezeigt, dass diese Bestimmungsmethode im Vergleich zu anderen Methoden sensibel (Nachweisgrenze bei 0,1 µmol/l Nitrit) und robust ist. Störungen durch Proteine (£ 1 mg/ml) oder SH-Verbindungen (£ 1 mmol/l), wie z.B. beim Griess-Assay vorhanden, treten hier keine auf.

Als basale NO﷓Bildungsraten wurden für Schweinekoronarien 350 pmol/10 mg Gewebe/30 min und für porcine Aortenendothelzellen (PAEC) 186 pmol/3x105 Zellen/30 min ermittelt. Unter Einfluss des unspezifischen NO- Synthase(NOS)-Inhibitors N-Methyl-L-Arginin (L-NMMA) kommt es zu einer signifikanten Hemmung der Nitrat/Nitrit-Bildung.

Alle in dieser Arbeit untersuchten Calciumkanalmodulatoren vom Dihydropyridin- Typ (DHP) (Amlodipin, Bay K 8644, Bay O 5572, Bay W 9798, Nifedipin, Nisoldipin, Nitrendipin) erhöhen die basale Nitrat/Nitrit-Bildung aus dem Gefäßendothel. Amlodipin ist bereits in einer Konzentration von 0,1 µmol/l wirksam, während dies bei den anderen DHP erst bei 10-fach höherer Konzentration der Fall ist. Mit L-NMMA ist die Wirkung von Nifedipin (als Vertreter der DHP) hemmbar. Unter Einfluss von Scherkräften wird die basale Nitrat/Nitrit-Freisetzung sowohl im nativen Gefäß als auch in der Endothelzellkultur 3-4-fach gesteigert. Diese Erhöhung ist mittels L-NMMA hemmbar. Nifedipin steigert auch unter Scherstress die Nitrat/Nitrit-Freisetzung, wobei das Verhältnis von basaler Freisetzung zu stimulierter Freisetzung unabhängig vom Scherstress ist.

Die Effizienz der Messung von basaler NO-Bildung und NO-Bildung unter Scherstress sowie der Einsatz der Methode in unterschiedlichen biologischen Systemen (z.B. auch Messung von NO im Effluat von Langendorff-Herzen) machen die in der vorliegenden Arbeit entwickelten Methode zu einer guten Alternative gegenüber den bisher genutzten Verfahren.

Most of the existing methods to measure NO are not sensitive enough to measure the permanent, basal NO formation taking place at the vascular endothelium. Therefore, this work presents how a procedure was developed and established which is sensitive enough to record the basal NO formation. After the endothelial formation the short half-life of NO leads directly to a stoichiometric transformation to nitrite and in a further oxidative step (stoichiometric) to nitrate, so that nitrite and nitrate can cumulate in the incubation medium. The concentration of free NO remains below the detection level. With the use of a nitrate reductase nitrate is converted back to nitrite, which in turn is reduced in an acidic iodide solution to NO and measured with the ISO-NO electrode. Due to the stoichiometry of the reactions no NO is lost, so that a cumulative measurement of formed nitrate/nitrite, determines the formed NO quantity.

It was shown that this method of determinating the NO amount is sensitive (detection limit 0,1 µmol/l nitrite) and stable in comperison to other methods. No disturbances arise from proteins (£ 1 mg/ml) or SH connections (£ 1 mmol/l) as in griess-assay.

Basal NO formation rates for pig coronaries were determined at 350 pmol/10 mg tissue/30 min and for porcine aortic endothelial cells (PAEC) at 186 pmol/3x105 cells/30 min. Under influence of the nonspecific NO synthase (NOS) inhibitor N-methyl-l-arginine (L-NMMA) the nitrate/nitrite formation is significantly inhibited.

All calcium channel modulators of the dihydropyridine type (DHP) (Amlodipin, Bay K 8644, Bay O 5572, Bay W 9798, Nifedipin, Nisoldipin, Nitrendipin) examined in this study increased the basal nitrate/nitrite formation from the vascular endothelium. Amlodipin is effective in a concentration of 0,1 µmol/l, whereas the other DHP become effective at a 10-fold higher concentration only L-NMMA again inhibits the effect of Nifedipin (as a representative of the DHP).

Under influence of shear stress the basal nitrate/nitrite release is increased 3-4 fold both in the native blood vessel and in the endothelium cell culture. This increase is repressed by means of L-NMMA. Nifedipin increases the nitrate/nitrite release under shear stress, whereby the relationship from basal release to stimulated release is not influenced.

The efficiency of the measurement of basal NO formation and NO formation under influence of shear stress as well as its application in different biological systems (e.g. including measurement of NO in the effluent of Langendorff- perused hearts) as described in this work offer a good alternative to the procedures used so far.