Identification and characterization of cancer stem cells in cutaneous malignant melanoma

Abstract

Cutaneous malignant melanomas result from neoplastic growth of melanocytes and are the most severe type of skin cancer. To improve overall survival, a better understanding of melanoma tumorigenesis is needed. Recent findings suggest that within almost all solid tumors in anology to hematopoetic tumors a small subpopulation of tumor cells exculsively have tumor initiating and propagating capacity. These so called cancer stem cells (CSCs) might also be the reason for the high rate of therapy failure, tumor relapse and metastasis. This study was aimed at establishing useful methods and identifying markers or combinations of markers to characterize CSCs in low-passage melanoma cells. After establishing primary melanoma cell cultures I identified subpopulations of melanoma cells that express CD133, which is correlated with asymmetric cell division and downregulated upon cell differentiation and OCT4A the master regulator of pluripotency. I enriched CD133+ as well as OCT4A+ cells from the bulk and found that crucial regulatory pathways related to oncogenesis and stemness such as Wnt, Hedgehog and Notch signaling are significantly overexpressed in the respective positive populations. I validated these results for the TGF-β signaling pathway, which is crucial to maintain the undifferentiated state in human embryonic stem cells (hESCs) on the protein level. I found this cascade exclusively activated in CD133+ melanoma cells. In addition, an overlap of both putative CSC populations was indicated by the overexpression of OCT4A in the CD133+ subpopulation compared to CD133- melanoma cells and vice versa. In vivo experiments showed enhanced tumor growth capabilities of CD133+ and OCT4A+ melanoma cells compared to their negative counterparts. Thus, CD133+ and particularly OCT4A+ melanoma cells comprise both the characteristics of stem-like cells and malignant tumors and provide strict criteria for self-renewal and asymmetric cell division to hold up the term of CSCs in solid tumors. Targeting these cells may lead to a more successful tumor intervention in the future. The dynamic conversion of tumor cell phenotypes that I have observed in my work could substantially hamper a successful therapeutic intervention. Until recently it was believed that tumor heterogeneity was due to a strict hierarchical order where only dedicated CSCs could fuel tumor-development and -fate in an unidirectional manner. My results indicate that a dynamic plasticity between both CSC and bulk tumor populations exists, which would explain tumor survival and rapid adaptation to unfavorable microenvironments like chemo- and radiotherapy. Further characterization of melanoma cancer stem cells and elucidation of the interconversion between tumor cell populations will be an important prerequisite for a lasting prevention of tumor recurrence and metastasis and may pave the way for better understanding tumor biology.

Das kutane maligne Melanom, eine bösartige Entartung der Melanozyten, stellt die gefährlichste Form von Hautkrebs dar. Um die Gesamtüberlebenszeit der Melanom¬patienten zu verlängern, ist ein besseres Verständnis der Mechanismen der Melanom-Tumorigenese notwendig. Studien legen nahe, dass fast alle Tumore eine kleine Subpopulation von Tumorzellen enthalten, die ausschließlich die Fähigkeit zur Tumorinitiierung und Selbsterneuerung besitzen. Diese sogenannten Krebsstammzellen stellen vermutlich auch die Ursache für das häufige Therapieversagen, sowie das Auftreten von Tumorrezidiven und Metastasen dar. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung geeigneter Methoden und Identifizierung eines geeigneten Markers oder einer Markerkombination für die Charakterisierung von Krebsstammzellen in primären, niedrig-passagigen Melanomzellen. Nach Etablierung primärer Melanom-Zellkulturen habe ich Subpopulationen von Melanomzellen identifiziert, die CD133 exprimieren, einem Marker, der mit asymmetrischer Zellteilung korreliert und während der Zelldifferenzierung herunterreguliert wird, sowie OCT4A, den wichtigsten Regulator der Pluripotenz. Ich habe CD133+ und OCT4A+ Zellen aus den Melanomkulturen isoliert und herausgefunden, dass wichtige regulatorische Entwicklungs- sowie krebsbezogene Signalwege signifikant in diesen Marker- positiven Populationen hochreguliert sind. Für den TGF-β-Signalweg, der in humanen embryonalen Stammzellen essenziell ist, um den undifferenzierten Zustand zu erhalten, habe ich diese Ergebnisse auf Proteinebene validiert. Die TGF-β-Kaskade war ausschließlich in CD133+ Melanomzellen aktiviert. Eine Überschneidung von beiden putativen Krebsstammzell-Populationen wurde außerdem durch Überexpression von OCT4A in der CD133+ Subpopulation im Vergleich zur CD133- Fraktion und vice versa angezeigt. In vivo Experimente zeigten schließlich, dass CD133+ und OCT4A+ Melanomzellen stärkere Tumor-initiierende und -propagierende Eigenschaften besitzen als CD133- und OCT4A- Zellen. Somit weisen CD133+ und OCT4A+ Melanomzellen sowohl die Eigenschaften von Stammzellen als auch malignen Tumorzellen auf und bieten strenge Kriterien für Selbsterneuerung und asymmetrische Zellteilung, um dem Begriff Krebsstammzellen in soliden Tumoren gerecht zu werden. Auf diese Zellen gerichtete Therapien könnten in der Zukunft effizientere Strategien zur Heilung von Melanompatienten darstellen. Die dynamische Konversion zwischen Krebsstammzell- und nicht-stammzellartigen Populationen, die ich während meiner Doktorarbeit beobachtet habe, könnte eine erfolgreiche therapeutische Intervention jedoch erschweren, weil sie das Tumorüberleben und eine rasche Adaption an Veränderungen im Tumorumfeld wie bei Chemo- und Strahlentherapie ermöglicht. Eine weitere Aufklärung der gegenseitigen Umwandlung von Tumorzellpopulationen wird die Voraussetzung für eine langanhaltende Verhinderung von Tumorrezidiven und Metastasen sein.