dc.contributor.author
Schumann, Benjamin
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:25:25Z
dc.date.available
2015-12-15T09:56:13.095Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7881
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12080
dc.description
Table of Contents 1 List of Abbreviations 5 List of Monosaccharides 7 Summary
9 Zusammenfassung 11 1 Introduction 1.1 Streptococcus pneumoniae 15 1.1.1
Pneumococcal Disease 15 1.1.2 Pneumococcal Capsules as Virulence Factors 16
1.2 Carbohydrate-based Vaccines 17 1.2.1 Bacterial Capsular Polysaccharides as
Vaccine Candidates 18 1.2.2 Immunology of Carbohydrate-based Vaccines 19 1.2.3
Antibodies and Their Role in Pneumococcal Disease 22 1.2.4 Production and
Manufacture of Glycoconjugate Vaccines 24 1.3 Opportunities and Challenges of
Vaccines Based on Synthetic Oligosaccharides 24 1.3.1 Chemical Immunology of
Synthetic Oligosaccharides 26 1.3.1.1 The Effect of Saccharide Length 26
1.3.1.2 The Effect of Exposed Epitopes 27 1.3.1.3 The Immunomodulatory
Properties of Zwitterionic Polysaccharides 27 1.4 Novel Developments in
Vaccine Design 28 1.4.1 Rational Vaccine Design 29 1.4.2 Epitope Discovery as
a Driving Force in Vaccine Development 30 1.4.2.1 Glycan Microarrays 30
1.4.2.2 Surface Plasmon Resonance 31 1.4.3 Liposomes as Novel Carrier
Platforms 32 1.5 Organic Chemistry Approaches to Manufacturing
Oligosaccharide-based Vaccines 33 1.5.1 The Glycosylation Reaction as a Key
Transformation in Carbohydrate Synthesis 33 1.5.2 Challenges Associated with
the Synthesis of Zwitterionic Polysaccharide Fragments 35 1.5.3
Stereoselectivity of Glycosylation Reactions 36 1.6 Aims of This Thesis 39 2
Synthesis and Immunological Evaluation of Conjugation-ready Zwitterionic
Oligosaccharides 2.1 Introduction 41 2.1.1 Commensal Bacteria 41 2.1.2
Zwitterionic Polysaccharides 42 2.1.3 Streptococcus pneumoniae Serotype 1 43
2.1.4 Conjugation-Ready Zwitterionic Oligosaccharides 44 2.1.5 Liposomal
Display of Antigen-Adjuvant Systems as Promising Vaccine Formulations 45 2.2
Results 46 2.2.1 Development of a Chemoselective Thioglycoside Activation
Strategy 46 2.2.2 Total Synthesis of a Conjugation-ready Sp1 Repeating Unit
Trisaccharide 50 2.2.3 Total Synthesis of a Conjugation-Ready PS A1 Repeating
Unit Tetrasaccharide 56 2.2.4 Synthesis of Conjugation-ready ZPS Repeating
Unit Fragments 60 2.2.5 Recognition of Synthetic ZPS Fragments by Components
of the Immune System 62 2.2.6 Evaluation of the Immune Response Against D-AAT
63 2.2.7 Evaluation of an Sp1 Trisaccharide Repeating Unit as a Vaccine Hapten
Against Streptococcus pneumoniae Serotype 1 66 2.2.8 Liposomal Presentation of
a Sp1 Trisaccharide as a Fully Synthetic Antigen Formulation 69 2.3 Conclusion
and Outlook 71 2.5 Experimental Section 75 2.5.1 Methods of Synthetic
Chemistry 75 2.5.2 Methods of Biochemistry 127 3 Reverse Engineering of
Antibodies Against Streptococcus pneumoniae Serotype 8 Capsular Polysaccharide
Using Synthetic Oligosaccharides 3.1 Introduction 133 3.1.1 Streptococcus
pneumoniae Serotype 8 133 3.1.2 Serotype 8 Capsular Polysaccharide 134 3.1.3
The Relevance of Monoclonal Antibodies Against Serotype 8 135 3.1.4 Reverse
Engineering of Antibodies as a Concept of Vaccine Design 135 3.2 Results 137
3.2.1 Glycotope Mapping of ST8-recognizing Antibody Samples 137 3.2.2 An
Optimized Chemical Synthesis of ST8 Frameshift C 139 3.2.3 Evaluation of the
Immune Response Against Synthetic ST8 Frameshifts A and C 143 3.2.4 Monoclonal
Antibodies Against ST8 Frameshift C Bind to Internal Glycotopes of Native ST8
Polysaccharide 148 3.2.5 Monoclonal Antibodies Against ST8 Frameshift C Bind
Serotype 8 Pneumococci and Protect from Lethal Pneumococcal Infection 152
3.2.5.1 Binding of Serotype 8 Pneumococci 152 3.2.5.2 Opsonophagocytic Killing
152 3.2.5.3 Passive Immunization 153 3.2.6 Synthesis of Oligosaccharides
Related to ST8 Frameshift C 154 3.2.7 Mapping of Protective and Non-protective
Glycotopes Within ST8 Frameshift C 160 3.7.2.1 Mapping a Non-protective
Glycotope Within ST8 Frameshift C 160 3.7.2.2 The Protective Glycotope Within
ST8 Frameshift C Does not Include the Terminal Glucuronic Acid 162 3.2.8
Mapping the Glycan Binding Characteristics of Opsonizing and Agglutinating
mAbs Against ST8 CPS 165 3.3 Conclusion and Outlook 169 3.3.1 Elucidation of a
Protective Glycotope of ST8 CPS 169 3.3.2 Characterization of Glycan Binding
Properties of Opsonizing and Agglutinating Monoclonal Antibodies Against ST8
172 3.5 Experimental Section 174 3.5.1 Methods of Synthetic Chemistry 174
3.4.2 Methods of Biochemistry 199 4.1 Introduction 207 4.2 Results 209 4.2.1
Design of Linker Alcohols with Distinct O-Nucleophilicities 209 4.2.2 Impact
of O-Nucleophilicity on the Stereoselectivity of Glycosylation Reactions 210
4.3 Conclusion and Outlook 214 4.4 Experimental Section 217 Bibliography 223
Curriculum Vitae 239
dc.description.abstract
Carbohydrate-based vaccines have successfully prevented infectious diseases in
the last decades. To date, several vaccines based on isolated capsular
polysaccharides (CPSs) are marketed against pathogenic bacteria such as
Streptococcus pneumoniae. The manufacture of these vaccines still suffers from
shortfalls associated with the isolation of CPSs from natural sources.
Furthermore, limited protectiveness of certain CPS antigens hampers vaccine
efficiency. Synthetic, structurally defined oligosaccharides present an
important alternative, with great potential to understand glycan immunology
and rationally engineer efficacious antigens. To that end, strategies are
needed to facilitate the streamlined design and generation of these antigens.
Novel synthetic methods fuel oligosaccharide assembly. Strategies to reverse
engineer antibodies enable the rational antigen design. Concomitantly,
optimizing the vaccine formulation helps to fine-tune the immune responses
elicited by oligosaccharide antigens. This work combines the development of
strategies in organic chemistry and biochemistry with in vivo immunological
evaluations to provide insight into the nature of optimized carbohydrate-based
vaccines against S. pneumoniae. Zwitterionic polysaccharides (ZPSs) have
gained attention due to their immunomodulatory properties that may render
these structures interesting vaccine components. The ZPS representative Sp1 is
an attractive vaccine target against S. pneumoniae serotype 1 (ST1) that is,
in turn, insufficiently covered by existing vaccines. The first part of this
work (Chapter 2) emcompasses the development of a chemoselective thioglycoside
activation method in the presence of thioethers that allowed for the first
total syntheses of conjugation-ready ZPS fragments. Glycan microarray analysis
of serum samples along with immunological evaluation in mice gave insights
into the immune recognition of conjugation-ready ZPS fragments. Finally, the
potency of a synthetic Sp1 trisaccharide as a vaccine antigen against ST1 was
evaluated in vivo. To facilitate the creation of next-generation vaccines,
strategies are needed to rationally design oligosaccharide antigens based on
first principles. Highly virulent S. pneumoniae serotype 8 (ST8) is not
included in modern conjugate vaccine formulations, and synthetic precedence on
ST8-derived oligosaccharides is scarce. The second part of this work (Chapter
3) comprises the elucidation of an oligosaccharide substructure that confers
protective immunity against ST8 CPS. A newly-designed, divergent synthetic
route provided access to a collection of ST8-related oligosaccharides. These
and other glycans were used to reverse-engineer a protective ST8 CPS-directed
monoclonal antibody (mAb) by glycan microarray analysis. A distinct
tetrasaccharide frameshift was found to harbor both protective and non-
protective, immunodominant glycotopes, and a murine mAb raised against this
frameshift protected mice from lethal pneumococcal infection. The molecular
details that govern different in vitro phenotypes of bacterial recognition by
a set of ST8 CPS-directed mAbs were investigated. Despite the progress in the
development of vaccine antigens based on synthetic oligosaccharides, several
shortcomings are still associated with the generation of glycosidic bonds.
Particularly, the 1,2-cis-stereoselective introduction of N-protected, amino
alcohol-derived linkers at the reducing end of oligosaccharides remains a
major challenge. Chapter 4 features the development of a linker that can be
introduced into synthetic oligosaccharides with excellent 1,2-cis-
selectivities. Lowering the O-nucleophilicity of a conventional, aliphatic
linker by introducing two fluorine substituents leads to a striking increase
of 1,2-cis-selectivities in glycosylation reactions. This effect is consistent
over a wide range of reaction conditions and facilitates the generation of
synthetic oligosaccharide antigens.
de
dc.description.abstract
Mittels kohlenhydratbasierter Impfstoffe konnte in den vergangenen Jahrzehnten
eine Vielzahl von Infektionskrankheiten verhindert werden. Eine Reihe
kommerziell erhältlicher Präparate beruht auf Kapselpolysacchariden pathogener
Bakterien wie Streptococcus pneumoniae. Allerdings ist die Produktion dieser
Impfstoffe oftmals aufwändig. Darüber hinaus sind bestimmte
Polysaccharidantigene nicht in der Lage, einen ausreichenden Impfschutz
hervorzurufen. Synthetische, strukturell definierte Oligosaccharide sind ein
vielversprechender Ansatz, um einerseits die Immunreaktionen des Körpers gegen
Zuckerstrukturen zu verstehen und andererseits hochwirksame Antigene gezielt
darszustellen. Allerdings müssen sowohl Entdeckung als auch Herstellung dieser
Antigene vereinfacht werden, was die Verbesserung bestehender Verfahren und
die Entwicklung neuer Herangehensweisen auf mehreren Ebenen erfordert.
Innovative Synthesemethoden sind zum einen essentiell zum Aufbau komplexer
Oligosaccharide. Der zielgerichteten Antigenentwicklung dient zum anderen die
Rekonstruktion von Antikörper-Kohlenhydrat-Interaktionen. Darüber hinaus
ermöglichen neue Methoden der Impfstoffformulierung die Optimierung der
Immunantwort gegen ein Oligosaccharidantigen. Diese Arbeit verbindet neuartige
Strategien der organisch-chemischen Synthese und der Biochemie mit
immunologischer Evaluierung synthetischer Antigene in vivo, um Aufschluss über
die Charakteristika optimierter Kohlenhydratimpfstoffe gegen S. pneumoniae zu
erhalten. Zwitterionische Polysaccharide (ZPSs) sind auf Grund ihrer
immunmodulierenden Eigenschaften für den Einsatz in Impfstoffen von Interesse.
Das ZPS-Molekül Sp1 ist darüber hinaus eine wichtige Zielstruktur zur
Impfstoffentwicklung gegen S. pneumoniae Serotyp 1 (ST1), einem Stamm, der von
existierenden Impfstoffen nur unzureichend abgedeckt wird. Der erste Teil
dieser Arbeit (Kapitel 2) behandelt die Entwicklung einer Methode zur
chemoselektiven Aktivierung von Thioglycosiden in Anwesenheit von Thioethern.
Mit Hilfe dieser Methode konnte die erste Totalsynthese konjugierbarer ZPS-
Substrukturen realisiert werden. Durch Glycan-Microarray-Analyse sowie
immunologische Evaluierung im Mausmodell konnte Aufschluss über die Erkennung
der ZPS-Fragmente durch Komponenten des Immunsystems erhalten werden.
Schließlich wurde die Eignung eines synthetischen Sp1-Trisaccharids als
Impfstoffkandidat gegen ST1 in vivo untersucht. Zur Erforschung neuartiger
Impfstoffe werden Methoden benötigt, um Oligosaccharidantigene zielgerichtet
auf Basis weniger Grundprinzipien zu entwerfen. Obwohl der hochvirulente S.
pneumoniae Serotyp 8 (ST8) kein Bestandteil kommerziell erhältlicher
Kohlenhydrat-Protein-Konjugatimpfstoffe ist, behandeln nur sehr wenige
Vorarbeiten die Synthese von ST8-basierten Oligosacchariden. Der zweite Teil
dieser Arbeit (Kapitel 3) beschreibt die Entdeckung einer
Oligosaccharidstruktur, die eine protektive Immunantwort gegen ST8 CPS
hervorzurufen vermag („protektives Glycotop“). Mit Hilfe einer neu
entworfenen, divergenten Synthesestrategie wurde eine Reihe ST8-abgeleiteter
Oligosaccharide hergestellt und zusammen mit anderen verfügbaren
Glycanstrukturen dazu verwendet, das Bindungsmuster eines protektiven, ST8
-Kapselpolysaccharid-gerichteten, monoklonalen Antikörpers (mAk) zu
rekonstruieren. Dabei stellte sich heraus, dass eine spezielle
Tetrasaccharidstruktur sowohl protektive als auch immunodominante,
nichtprotektive Glycotope enthält. Ein in Mäusen durch Immunisierung mit einem
entsprechenden Glycokonjugat hergestellter mAk gegen dieses Tetrasaccharid
schützte Mäuse vor einer tödlichen Infektionsdosis mit Pneumokokken. Außerdem
wurden die molekularen Grundlagen untersucht, die zu Unterschieden in der
Bakterienerkennung durch verschiedene mAks in vitro führen. Dieser Teil der
Arbeit beschreibt eine gegenüber herkömmlichen Herangehensweisen stark
vereinfachte Strategie zur zielgerichteten Entwicklung oligosaccharidbasierter
Impfstoffantigene. Trotz großer Fortschritte bei der Entwicklung von
Impfstoffantigenen auf Basis synthetischer Oligosacccharide bestehen noch
immer große Probleme mit deren organisch-chemischer Synthese, insbesondere mit
der Knüpfung glycosidischer Bindungen. Vor allem die 1,2-cis-stereoselektive
Einführung N-geschützter Aminoalkohole, die als Linker der späteren
chemoselektiven Konjugation des ungeschützten Glycans dienen, stellt eine
große synthetische Herausforderung dar. In Kapitel 4 wird die Entwicklung
eines neuartigen Linkers beschrieben, der sich mit ausgezeichneten 1,2-cis-
Stereoselektivitäten in synthetische Oligosaccharide einbringen lässt. Durch
Einführung von zwei Fluorsubstituenten wurde die O-Nukleophilie eines
herkömmlichen, aliphatischen Linkers stark herabgesetzt, was zu einer
beachtlichen Erhöhung der 1,2-cis-Selektivitäten in Glykosylierungsreaktionen
führte. Dieser Effekt zeigte sich für eine große Bandbreite an
Reaktionsbedingungen und sollte daher die Herstellung von konjugierbaren
Oligosaccharidantigenen in Zukunft wesentlich vereinfachen.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Synthetic Oligosaccharide
dc.subject
Streptococcus pneumoniae
dc.subject
Zwitterionic Polysaccharide
dc.subject
Glycoconjugate
dc.subject
Monoclonal Antibody
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Synthesis and Immunological Evaluation of Oligosaccharide-Antigens as Vaccine
Candidates for Streptococcus pneumoniae Serotypes 1 and 8
dc.contributor.contact
benjamin.schumann@mpikg.mpg.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Markus Wahl
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Peter H. Seeberger
dc.date.accepted
2015-11-24
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000100748-7
dc.title.translated
Synthese und immunologische Evaluation von Oligosaccharidantigenen als
Impfstoffkandidaten für Streptococcus pneumoniae Serotypen 1 und 8
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000100748
refubium.note.author
Copyright-Verträge bestehen mit Verlagen, die Teile der Arbeit veröffenticht
haben. Die Verlage haben der Veröffentlichung in der Dissertation zugestimmt
(die Verträge können gern nachgereicht werden).
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FUDISS_derivate_000000018302
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