Structural and functional studies of growth arrest and DNA-damage proteins

Abstract

The expression of genes encoding growth-arrest and DNA-damage-inducible 45 (GADD45) proteins can be induced by various genotoxic and non-genotoxic stresses. The human GADD45 proteins play an important role in cell growth and proliferation regulation with specific functions in cell-cycle control, MAPK signaling, apoptosis, and immune response. There are three mammalian GADD45 proteins (α, β, and γ). All are primarily localized in the nucleus, display general antiproliferative activity and are highly homologous to each other. They differ in the expression pattern and in their activation mechanism. To highlight differences, it is GADD45α which can halt the cell-cycle progression at G2/M transition upon DNA damage while GADD45γ is the only family member induced by IL-2. Furthermore, negative growth control is mediated by physical interactions with the proliferating-cell nuclear antigen (PCNA). For this reason, it has been suggested as a possible therapeutic target for anaplastic thyroid cancer. Importantly, all three GADD45 proteins contain LXXLL motifs (X is any amino acid), which has been suggested to be required for hormone- receptor binding. Until recently, there was no structural information on any of the GADD45 proteins. Being important members of cell-cycle regulatory cascades and tumor and autoimmune suppressors, I characterized the structure and function of this group of proteins, especially GADD45γ. I have determined the crystal structure of human GADD45γ which reveals an α/β-plait topology. More¬over it forms a homodimer in the crystal which is in agreement with dimers in solution as confirmed by analytical ultracentrifugation and analytical gel filtration. Despite low sequence similarity the structure shows striking resemblance to large-subunit ribosomal proteins, especially L7Ae, and therefore justifies its classification under the L7Ae/L30e/S12e ribosomal protein superfamily. Inspection of the crystal packing revealed more than one possible interaction of monomers that could generate the expected dimer. Using mutagenesis, small angle X-ray scattering and fluorescence spectroscopy, I tried to identify the correct dimer interface. Surprisingly, the three LXXLL motifs present in the GADD45γ sequence and implicated in nuclear receptor binding are buried inside the dimer and inacces¬sible to ligand proteins. Never¬the¬less, a physical interaction of GADD45γ with the ligand-binding domain of nuclear receptor protein PPARγ was demonstrated by analytical ultracentrifugation as well as pull-down assays. Mutagenesis of leucines in the LXXLL motif supported the prediction based on the crystal structure that this motif plays no role in nuclear receptor binding. Therefore, it is most likely that the inter¬action of GADD45γ with nuclear receptors like PPARγ is mediated by residues other than LXXLL. Using analytical ultracentrifugation, a binding stoichiometry of 2:1 (PPARγ: GADD45γ) was also established. However, this complex formation was not observed in other biochemical experiments, and co-crystallization experiments yielded crystals containing only PPARγ, thereby suggesting that this interaction might be weak and/or transient, occurring at cellular level only or maybe stabilized by further factors currently unknown. The successful crystal structure analysis of GADD45γ led me to attempt the crystallization of GADD45α. Using a thermofluor assay, a wide array of buffers and pH conditions were screened for their stabilizing effect on GADD45α. Although it displayed favorbale biophysical properties this protein proved recalcitrant to crystallization under various buffer, pH, additive or redox conditions. Therefore, limited proteolysis and analysis with in silico tools were employed to identify crystallizeable protein forms. The removal of the N-terminus as suggested by a structural alignment with GADD45γ did not render this protein amenable to crystallization. The presence of high-molecular- weight aggregates as well as the protein's hydrophobicity could explain the non-crystallizeability of GADD45α. In further experiments I attempted to co- crystallize GADD45α with its binding partner PCNA without obtaining diffraction-quality crystals. Complex formation could be shown in vitro, but co-crystallization experiments yielded crystals that contained only PCNA. Future attempts to gain structural insight into this protein could benefit from this study.

Die Expression von Genen, die für sogenannte growth-arrest and DNA-damage- inducible 45 (GADD45) Proteinen codieren, kann durch verschiedenen genotoxischen und nicht-genotoxischen Stress induziert werden. Humanes GADD45 spielt eine wichtige Rolle beim Zellwachstum und Proliferationsregulierung mit spezifischen Funktionen in der Zellzykluskontrolle, MAPK Signaltransduktion, Apoptose und Immunantwort. Bei Säugetieren werden drei Arten von GADD45 unterschieden: α, β und γ. Diese drei homologen Proteine sind hauptsächlich im Zellkern zu finden und zeigen eine allgemeine antiproliferative Aktivität. Unterschiede finden sich in ihrem Expressionsmuster und dem Aktivierungsmechanismus. So kann GADD45α bei DNS-Schäden den Verlauf des Zellzykluses beim Übergang der G2- zur M-Phase arretieren, wohingegen GADD45γ ausschließlich durch IL-2 induziert wird. Außerdem wird die negative Wachstumskontrolle duch physische Interaktion mit dem proliferating-cell nuclear antigen (PCNA) vermittelt. Aufgrund dessen wird GADD45 als ein mögliches therapeutisches Ziel für anaplastischen Schilddrüsenkrebs angesehen. Alle drei GADD45 Proteine weisen bedeutende LXXLL-Motive (X steht für eine beliebige Aminosäure) auf, die wahrscheinlich für die Bindung an Hormonrezeptoren benötigt werden. Es war bis vor kurzem keinerlei strukturelle Information dieser Proteine verfügbar. In der vorliegenen Arbeit habe ich die Struktur und Funktion dieser für die Zellzykluskontrolle und Autoimmunsuppression wichtigen Gruppe von Proteinen, insbesondere von GADD45γ, charakterisiert. Ich habe die Kristallstruktur des humanen GADD45γ mit einer α/β-plait Topologie bestimmt. Übereinstimmend mit den Ergebnissenaus der analytischen Ultrazentrifugation und analytischen Gelfiltration wurde auch im Kristallgitter ein Homodimer gefunden. Trotz geringer Sequenzähnlichkeit ähnelt die Struktur derer von Proteinen der großen ribosomalen Untereinheit, insbesondere L7Ae, und rechtfertigt die Klassifikation von GADD45 zu der L7Ae/L30e/S12e ribosomalen Proteinfamilie. Aufgrund der Kristallpackung ist die Bildung von Dimeren über unterschiedliche Grenzflächen möglich. Mittels Mutagenese, Kleinwinkelröntgenstreuung und Fluoreszenz¬spektroskopie, habe ich die verschiedenen Möglichkeiten Dimerisierung von GADD45gamma eingehender untersucht. Erstaunlicherweise befinden sich alle drei LXXLL-Motive von GADD45γ im Inneren des Proteins und sind für eine mögliche Ligandenbindung, beispielsweise von Kernrezeptoren, nicht zugänglich. Eine direkte Bindung von GADD45γ mit der Liganden-bindenen Domäne des Kernrezeptors PPARγ konnte nichtsdestotrotz mittels analytischer Ultrazentrifugation und Interaktionstudien (pull-down assays) gezeigt werden. Wie bereits aus der Struktur ersichtlich zeigt auch die Mutagenese der Leucinreste des LXXLL- Motivs, dass diese Motive nicht für die Rezeptorbindung benötigt werden. Aufgrund dessen ist es sehr wahrscheinlich, dass andere Seitenketten für die Interaktion von GADD45γ mit Kernrezeptoren wie PPARγ verantwortlich sind. Das stöchiometrische Verhältnis von 2:1 (PPARγ: GADD45γ) wurde mit Hilfe analytischer Ultrazentrifugation ermittelt. Diese Komplexbildung konnte allerdings in anderen biochemischen Experimenten nicht bestätigt werden. Bei dem Versuch der Co-Kristallisation wurde ausschließlich PPARγ-Kristalle erhalten. Vermutlich handelt es sich um eine schwache und/oder transiente Interaktion oder diese wird durch weitere, bislang unbekannte, Faktoren beeinflusst. Aufgrund der erfolgreichen Strukturbestimmung von GADD45gamma versuchte ich darauffolgend GADD45alpha zu kristallisieren. Um geeignete Ausgangsbedingungen zu finden, wurde mit Hilfe eines Thermoflur Assays eine Vielzahl von Pufferlösungen und pH-Werten auf eine stabilisierende Wirkung von GADD45α gestestet. Trotz günstiger biophysikalischer Eigenschaften und einer großen Anzahl von stabilisierenden Pufferlösugen, pH-Werten und Additiven konnnte keine geeignete Kristallisationbedingung gefunden werden. Durch limitierende Proteolyse und in silico-Analyse wurde versucht, ein kristallisierbares Konstrukt zu identifizieren. Auch die, aufgrund eines Sequenzvergleichs mit GADD45γ naheliegende Entfernung des N-Terminus´ verbesserte die Kristallisierbarkeit nicht. Vermutlich wurde die Kristallisation durch hochmolekulare Aggregate und/oder die Hydrophobizität verhindert. Auch bei dem Versuch einen Komplex aus GADD45α und PCNA zu kristallisieren, wurden keine Kristalle mit geeigneten Diffraktionseigenschaften gefunden. Obwohl die Komplexbildung in vitro gezeigt werden konnte, wurden ausschließlich PCNA-Kristalle erhalten. Zukünftige strukturelle Studien dieses Proteins können jedoch auf der vorliegenden Arbeit aufbauen.