Carbohydrates, also referred to as glycans or oligosaccharides, are biomolecules that play an important role in all living organisms. They are, for example, involved in cell-cell recognition, protein folding or the development of cancer. Oligosaccharides consist of monosaccharide building blocks, which are often isomers that only differ in the stereochemistry at individual carbons. Additionally, they contain several hydroxyl groups that can be connected to other monosaccharides via the formation of a glycosidic bond. This often results in branched structures with a complex regio- and stereochemistry. The high structural diversity of glycans provides an enormous challenge for almost all areas of the glycosciences. A promising technique for the structural investigation of carbohydrates is ion mobility-mass spectrometry (IM-MS). IM-MS measures the mass-to-charge ratio (m/z) of ions as well as the time they need to traverse a cell, filled with inert gas, under the influence of a weak electric field. Ions are separated according to their mass, charge, size, and shape, which enables the differentiation of isomers. In addition, an obtained drift time can be converted into a collision cross section (CCS), which is a molecular property that can be universally compared. In this thesis, the potential of IM-MS for the structural analysis of glycans was investigated. First, a variety of N-glycans and the polysaccharide dextran were examined and the absolute CCSs of their intact ions and fragments reported. Subsequently, these reference values were used to establish a CCS calibration procedure for commercial traveling wave IM-MS instruments. In addition, the influence of the utilized drift gas and the ion’s charge on the quality of a calibration were investigated. To assess the capability of IM-MS, a systematic study was performed using a set of six synthetic carbohydrates that represent all possible types of isomerism. It was shown that regio- and stereoisomers can be identified and separated when analyzed as deprotonated ions. Furthermore, the relative concentration of an isomer in a mixture was determined. With the increasing size of glycans it becomes exceedingly more difficult to identify small structural differences. In this thesis, it was shown that fragments, which contain two to five monosaccharides, are often more informative than their precursor ions. This can be exploited to identify common glycan motifs within larger glycans, based on characteristic fragments with unique CCSs. It was, for example, shown that blood group epitopes can function as such marker fragments. In addition, N-acetylneuraminic acids, linked either via an α2→3 or α2→6 glycosidic bond to larger glycans, were identified using characteristic fragments. The application of this approach is independent of the type of precursor and was successfully applied to N-glycans, milk sugars and glycopeptides. Overall, IM-MS can be used to generate dual sets of m/z and CCS information, which form unique signatures that enable a fast and accurate identification of glycans. The data are ideally suited to be implemented into databases and provide the basis for the future development of automated, high-throughput glycan analysis.
Kohlenhydrate, oft auch als Glykane oder Oligosaccharide bezeichnet, sind Biomoleküle, die praktisch in allen lebenden Organismen eine wichtige Rolle spielen. Sie sind unter anderem beteiligt an der Zellerkennung, der Proteinfaltung oder der Entstehung von Krebs. Oligosaccharide bestehen aus Monosaccharid-Bausteinen, welche häufig Isomere sind und sich oft nur in der Konfiguration einzelner Kohlenstoffatome unterscheiden. Sie besitzen zudem mehrere Hydroxylgruppen, an denen glykosidische Bindungen zu weiteren Monosacchariden entstehen können. Dies kann zur Bildung von linearen sowie verzweigte Strukturen führen, welche eine komplexe Regio- und Stereochemie besitzen. Die dadurch entstehende immense strukturelle Vielfalt stellt eine große Herausforderung für fast alle Zweige der Glykowissenschaften dar. Eine vielversprechende Methode zur Strukturanalyse von Glykanen ist die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS). Mit dieser wird sowohl das Masse- zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) eines Ions gemessen als auch die Zeit, welche es benötigt, unter dem Einfluss eines schwachen elektrischen Feldes eine mit Inertgas gefüllte Zelle zu durchqueren. Dabei erfolgt eine Trennung der Ionen anhand ihrer Masse, Ladung, Größe und Form, welche auch die Unterscheidung von Isomeren ermöglicht. Zusätzlich kann aus einer gemessenen Driftzeit der Kollisionsquerschnitt (CCS) eines Ions berechnet werden, welcher eine Moleküleigenschaft darstellt, die universell vergleichbar ist. In dieser Arbeit wurde das Potenzial der Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie für die Strukturaufklärung von Kohlenhydraten untersucht. Zunächst wurden eine Reihe von N-Glykanen sowie das Polysaccharid Dextran analysiert und die CCSs ihrer intakten Ionen und Fragmente gemessen. Diese Referenzwerte konnten im Anschluss verwendet werden, um eine CCS Kalibrationsmethode für kommerziell erhältliche traveling wave IM-MS Instrumente zu entwickeln. Zusätzlich wurde der Einfluss des Driftgases sowie der Ladung der Ionen auf die Qualität der Kalibration betrachtet. Um das Leistungsvermögen von IM-MS zu untersuchen, wurde eine systematische Studie anhand von sechs synthetischen Oligosacchariden durchgeführt, welche alle möglichen Arten der Isomerie repräsentierten. Es zeigte sich, dass Regio- oder Stereoisomere als deprotonierte Ionen eindeutig identifiziert und getrennt werden können. Außerdem ist die Bestimmung der relativen Konzentration eines Isomers innerhalb einer Mischung möglich. Mit zunehmender Größe der Kohlenhydrate wird es jedoch schwieriger, kleine Strukturunterschiede zu identifizieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Fragmente, welche zwei bis fünf Monosaccharide enthalten, häufig informativer sind als ihre Vorläuferionen. Dies konnte genutzt werden, um weit verbreitete Glykanmotive innerhalb von größeren Kohlenhydraten anhand von speziellen Fragmenten mit charakteristischen CCSs zu identifizieren. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass Blutgruppenepitope ideale Marker-Fragmente darstellen. Außerdem wurden N-Acetylneuraminsäuren, welche entweder über eine α2→3 oder α2→6 glykosidische Bindung an Glykane gebunden sind, mit diesem Ansatz identifiziert. Die beschriebene Methode lässt sich unabhängig von der Art der zu analysierenden Probe verwenden und eine Anwendung bei N-Glykanen, Milch- Oligosacchariden sowie Glykoproteinen wurde hier gezeigt. Die Analyse mittels IM-MS ermöglicht es somit, einen dualen Datensatz aus m/z und CCS Informationen zu erstellen, welcher für jedes Molekül eine einzigartige Signatur ergibt. Dies ermöglicht eine schnelle und verlässliche Identifizierung von Glykanen. Die Daten sind zudem ideal geeignet, um in Datenbanken implementiert zu werden, und sie bilden somit die Grundlage für die zukünftige Entwicklung automatisierter Hochdurchsatz-Analysen.
