Kollagen XIV und CD44 – Einfluss auf Proliferation und Differenzierung bei mesenchymalen und hämatopoetischen Zellen

Abstract

In dieser Arbeit wurde die Wirkung von Kollagen-Typ XIV (KXIV), einem Bestandteil der extrazellulären Matrix (EZM), auf Proliferation und Differenzierung von Zellen mesenchymalen und hämatopoetischen Ursprungs untersucht. Dabei wurden die Zelllinien 3T3-L1 und U937 als Modell für unipotente Präadipozyten bzw. für myelomonozytäre Progenitorzellen eingesetzt. Als Maß der Zellproliferation wurde der Einbau von radioaktiv-markiertem Thymidin bestimmt. Ergänzend wurden direkte und indirekte Zellzahl- und Vitalitätsbestimmungen mittels Hämatozytometer, der Bestimmung intrazellulärer Esterasen bzw. Vitalfärbung mit Propidiumjodid in der Durchflusszytometrie durchgeführt. Bei den 3T3-L1-Zellen wurden Differenzierungsprozesse anhand der intrazellulären Bildung von Fetttröpfchen beurteilt. Der Nachweis erfolgte optisch über die Färbung der Lipidtropfen mittels Oil-Red-O. Ergänzend wurde die Expression des Glukosetransporters GLUT4 im Western-blot untersucht. Bei U937-Zellen wurde die Differenzierungsinduktion durchflusszytometrisch anhand der Expression spezifischer Oberflächenmarker bewertet. Es konnte gezeigt werden, dass das Gesamtmolekül KXIV sowohl bei den präadipozytären 3T3-L1-Zellen, als auch bei den malignen myeloischen U937-Zellen die DNS- Synthese in vitro um 30 bis 45% signifikant reduziert. Das rekombinante Fragment KXIV29-154 erzielte eine gleichwertige Reduktion der Zellproliferation (3T3-L1) bzw. übertraf den antiproliferativen Effekt des Gesamtmoleküls (U937) und bewirkte eine Reduktion der Proliferation um 70%. Die Vitalität der Zellen blieb jeweils unverändert, weshalb Apoptose ausgeschlossen werden konnte. Sowohl das Gesamtmolekül KXIV als auch das Fragment KXIV29-154 induzierten die Differenzierung der Zelllinie 3T3-L1. Es konnte eine Einlagerung von intrazellulären Fetttröpfchen sowie eine Hochregulation von GLUT4 nachgewiesen werden. Ein solcher Differenzierungs- induzierender Einfluss von KXIV oder seinem Fragment wurde für die Zelllinie U937 nicht gefunden. Die späten Differenzierungsmarker wie CD14, CD11b, CD16 und CD64 wurden weiterhin nicht exprimiert. Allerdings war in Gegenwart des Fragmentes KXIV29-154 das Oberflächenmolekül αLβ2 (CD11a/CD18) aus der Gruppe der Integrine um den Faktor 2 hochsignifikant hochreguliert. Dies könnte auf die physiologische Beteiligung von EZM-Molekülen an Prozessen wie Adhäsion, Extravasation, Migration und Chemotaxis hinweisen. CD44 wurde von anderen als KXIV-Rezeptor identifiziert, weshalb in dieser Arbeit anhand der Zelllinie U937 die Effekte von KXIV auf den Rezeptor mit denjenigen ausgewählter CD44-spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) verglichen wurden. Analogien gab es hinsichtlich der Hochregulation von CD11a/CD18 um den Faktor 2. Allerdings wurden auch Unterschiede beobachtet. Die Proliferationsrate bzw. mitotische Aktivität der malignen myeloischen Zellen blieb unbeeinflusst. Dafür wurde eine de-novo Expression der Antigene CD15 und CCR7 beobachtet. Versuchsreihen, in denen KXIV29-154 und CD44-spezifische mAbs kombiniert zu der Zelllinie U937 gegeben wurden, erbrachten eine synergistische Koaktivierung mit signifikanter Verstärkung des antiproliferativen Effektes und der Antigenexpression.

The study analyzes the effects of collagen XIV (CXIV), which is part of the extracellular matrix (ECM), on proliferation and differentiation of mesenchymal and hematopoietic cells. Therefore, 3T3-L1 and U937 were used as models for unipotent preadipocytes and myelomonocytic progenitor-cells. Cell proliferation was measured by radioactive-marked thymidin. In addition, direct and indirect cell count and vitality were detected by Neubauer-cytometer, intracellular esterase and vital staining with propidium jodid in FACS. Differentiation was detected by staining of intracellular lipid droplets with Oil-Red-O and expression of glucose transporter type 4 (GLUT4) in western-blot (3T3-L1) and accordingly by expression of specific surface antigens in FACS (U937). This study shows that CXIV can reduce in vitro DNA-synthesis about 30 to 45% (3T3-L1 and U937). The recombinant fragment CXIV29-154 achieves the same reduction (3T3-L1) or outnumbers the anti-proliferative effect of the entire molecule and effects a reduction of proliferation up to 70% (U937). The vitality of the cells remains unchanged, so apoptosis did not occur. Both CXIV and its fragment CXIV29-154 induced differentiation of the cell line 3T3-L1. Intracellular lipid droplets as well as the expression of GLUT4 could be detected. By contrast, cell line U937 did neither differentiate by the influence of CXIV, nor by its fragment. The late markers of differentiation, such as CD14, CD11b, CD16 and CD64, were still missing. However, the integrine CD11a/CD18 raised its expression in presence of the fragment CXIV29-154 in a significant way up to factor 2. This could indicate a physiologic involvement of ECM-molecules on adhesion, extravasation, migration, and chemotaxis. Previous research detected CD44 as receptor of CXIV. Therefore, in this study the effects of CXIV were compared with selected CD44-specific monoclonal antibodies (mAb). The same effect could be found concerning the up-regulation of CD11a/CD18, but there were also differences. The proliferation of the U937-cell line remained the same and an additional de-novo expression of CD15 and CCR7 was detected. In another series of tests, CXIV29-154 combined with specific CD44-mAbs were given to cell line U937. This generated a synergistic co-activation with significant increase of the anti-proliferative effect and antigen-expression.