Adressierung von Adhäsionsrezeptoren durch synthetische Liganden

Abstract

Adhäsionsrezeptoren übernehmen zentrale Aufgaben bei Zell Zell Kontakten und bei der Anbindung von Zellen an die extrazelluläre Matrix. Selektine spielen eine dominante Rolle bei der Rekrutierung von Leukozyten in entzündetes Gewebe. Wichtig im Rahmen der angeborenen Immunität zum Bekämpfen von Pathogenen, aber ungewollt bei überschießender Entzündung, wie beispielsweise bei Autoimmunkrankheiten, ist die Modulation dieses Prozesses auf der Ebene der Selektine ein vielversprechender therapeutischer Ansatzpunkt. Mit Fokus auf das leukozytäre L Selektin beschreibt diese Arbeit Ansätze zur Adressierung von Adhäsionsrezeptoren. Rationales Design von spezifischen Proteinbindern erfordert die Kenntnis der Zielstruktur. Nicht immer sind entsprechende Kristallstrukturen vorhanden, können aber anhand bekannter, ähnlicher Strukturen modelliert werden. Hier wurden Selektinstrukturen auf der Basis der bekannten P Selektin und E Selektin Struktur modelliert und über Affinitätsmessungen generierter Mutationen von L Selektin die Modelle verifiziert. Die Punktmutationen denen laut Modell eine Schwächung der Bindung prognostiziert wurde (R46A, K85A, E88D), zeigten in SPR Bindungsstudien signifikant höhere KD Werte verglichen mit nicht mutiertem L Selektin (das heißt R46A 2,1 fach, K85A 2,3 fach und E88D 2,9 fach höher). Die Mutation, für die eine stärkere Bindung an Sialyl Lewisx (sLex) berechnet wurde (D107E), zeigte an einem Polymerliganden der nur sLex präsentiert signifikant stärkere Affinität (2,1 fach stärker), an einem Polymerliganden der sLex und sulfatiertes Tyrosin (sTyr) präsentiert, aber keinen Unterschied zu nicht mutiertem L Selektin. Hier wird der Affinitätsgewinn an das sLex durch die starke Interaktion mit sTyr maskiert. Binder können aber auch durch nachträgliche Optimierung einer Struktur rational designt werden, die durch nicht rationale, evolutionäre Techniken wie SELEX entstanden sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein L Selektin spezifisches DNA Aptamer hinsichtlich seiner Struktur Wirkungs Beziehung charakterisiert und die Sequenz auf wesentliche, bindungsrelevante Abschnitte verkürzt. Die entstandene finale Struktur zeigt eine höhere Stabilität ohne ihre hohe Bindungsaffinität zu verlieren, wobei Affinität und Spezifität auch durch Anwendung in einer Affinitätschromatographie demonstriert wurden. Trotz der Verkürzung um 8 Basen besitzt das Aptamer jetzt eine um 7°C höhere Schmelztemperatur und ein inhibitorisches Potential im SPR basierten L Selektin Inhibitionsassay von IC50 = 11 nM, welches vergleichbar mit dem IC50 der originalen Struktur ist (8 nM). Dimerisierung der verkürzten Struktur verbesserte den IC50 um ein 30-faches auf 0,3 nM. L Selektin zeigt bei direkter Bindung an die neue Struktur eine Affinität von KD = 11 nM. Die Verwendung nicht spezifischer Binder erfordert weitergehende Untersuchungen im Hinblick auf Bioverteilung, Akkumulation und off-target Effekte. Teile dieser Arbeit beschreiben zwei unterschiedliche Ansätze (anisotropische Goldnanostäbchen zur optoakustischen Bildgebung und intrinsische Fluoreszenz bspw. für die Fluoreszenzmikroskopie) zum Monitoring nicht-spezifischer L Selektin Inhibitoren zur Anwendung in vivo und in vitro. Da das inhibitorische Potential nicht spezifischer Polysulfate größtenteils von Größe und Ladung abhängt, rücken Fragen zur Biokompatibilität und Ausscheidung aus dem Organismus in den Fokus. Deshalb wurden Polysulfate mit spaltbaren Linkern neben inhibitorischem Potential auch auf Blutkompatibilität untersucht. Während die antiinflammatorischen Eigenschaften sowie der Einfluss auf die Blutgerinnung der Polyanionen mit den spaltbaren Linkern, mit denen der Grundstruktur ohne spaltbare Linker (dPGS) vergleichbar ist, weisen die spaltbaren dPGS Derivate aber einen verstärkten Einfluss auf die Blockade des Komplementsystems auf. Die Polysulfate mit intrinsischer Fluoreszenz, die sulfatierten Perylenbisimide (sPBI), zeigen mit steigender Anzahl an Sulfaten von Generation 1 (G1) bis Generation 4 (G4) eine Verbesserung des antiinflammatorischen Potentials um jeweils das 4-6 Fache. G4 mit 64 Sulfaten ist dann um das 30-fache potenter (IC50 = 11 nM) als ein dPGS Molekül mit vergleichbarer Größe und vergleichbarer Anzahl an Sulfaten (IC50: 300 nM). Hinsichtlich der Biokompatibilität steigt mit der Anzahl der Sulfate auch der Einfluss auf Blutgerinnung und Komplementaktivität. Dieser ist bei sPBI-G1 und sPBI-G2 bis 1 µM vernachlässigbar gering. Aber auch für sPBI-G3 und sPBI-G4 zeigt sich im Bereich des jeweiligen IC50 noch kein Einfluss auf die Blutkompatibilität. Die Änderung der Größe eines multivalenten Inhibitors kann die Bindungsaffinität an ein multivalentes Target beträchtlich beeinflussen. Dadurch gewinnt ein anderer Faktor an Bedeutung, da größere Inhibitoren zusätzlich zum Anstieg der Affinität in der Lage sind, allein durch ihre Größe eine entsprechende Fläche am Binder abzuschirmen. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es den Autoren, die sterische Abschirmung bei globulärer Inhibition mathematisch zu beschreiben und vom Multivalenzeffekt zu trennen.

Adhesion receptors take over vital tasks in the attachment of cells to the extracellular matrix and in cell to cell binding communication. Here the selectins play a dominant role in the recruitment of leukocytes to inflamed tissue. Desired in innate immunity to fight pathogens, but unwanted for example in autoimmune diseases, modulation of cell-cell recognition mediated by the selectins is a promising therapeutically approach. Focusing on L-selectin which is presented by leukocytes, this work describes approaches to target adhesion receptors. Rational design of specific protein binders requires the knowledge of the target structure. However, if crystal structures aren´t available, configurations can be modelled based on known closely related structures. Selectin structures were modelled on the basis of a known P selectin and E selectin structure and subsequently verified via binding affinity of generated L selectin mutants. The point mutations that were predicted to weaken the binding (R46A, K85A, E88D), showed significantly higher KD values in SPR binding studies compared to non mutated L selectin (i.e. R46A 2.1 times, K85A 2.3 times und E88D 2.9 times higher). The mutation, for which a stronger binding to sialyl Lewisx (sLex) was calculated (D107E), showed a significantly stronger binding to a polymeric ligand that presented only the sLex epitope (2.1 fach stronger), but didn’t show any difference compared to the non mutated L selectin when bound to a polymer presenting both sLex and sTyr. Here the gain in affinity to sLex is hidden by strongly interacting sTyr ligands. Rational design could be also achieved by applying non rational evolutionary techniques like SELEX and further optimizing the ligand structure. Here an L-selectin specific DNA aptamer was characterized regarding its structure-function relationship and shortened to sections relevant for binding affinity. This approach yielded a final structure with higher stability without losing its high binding affinity and specificity, also demonstrated by its application as a ligand in a single step affinity chromatography. Despite the shortening by 8 bases, the aptamer now features a 7°C higher melting temperature and an inhibitory potential of IC50 = 11 nM in the SPR based L selectin inhibition assay. This is comparable to the result of the original structure (IC50 = 8 nM). Dimerization of the shortened structure improved the IC50 by 30-fold yielding a value of 0,3 nM. L selectin itself shows a direct binding affinity to the new structure of KD = 11 nM. The use of non specific binders demands a closer look on biodistribution, accumulation and off target effects. In this work two different approaches (anisotropic gold nanorods for optoacoustic imaging and intrinsic fluorescence e.g. for fluorescence microscopy) of monitoring non specific L selectin inhibitors are presented. One for the use in vivo and the other one suited for in vitro experiments. As inhibitory potential is mainly dependent on size and charge of these non specific polysulfates, biocompatibility and clearance are reaching the focus. Therefore cleavable linker equipped polysulfates for better clearance were probed for inhibitory potential and blood compatibility as well. While the polyanions with cleavable linkers have comparable properties compared to the template structure without cleavable linkers (dPGS) regarding anti-inflammatory potential as well as the influence on blood coagulation, the cleavable dPGS derivatives demonstrate a more potent anti-complement activity. The polysulfates with intrinsic fluorescence, the sulfated perylenebisimides (sPBI), show an increasing anti-inflammatory potential by the 4-6 fold with increasing number of sulfates from generation 1 (G1) to generation 4 (G4). G4 with 64 sulfates is 30-fold more potent (IC50: 11 nM) than a dPGS-molecule of comparable size and with a comparable number of sulfates (IC50: 300 nM). Regarding the biocompatibility, the impact on blood coagulation and complement activity rises with the number of sulfates. In sPBI-G1 and sPBI-G2, this impact is negligible below 1 µM. But even for sPBI-G3 and sPBI-G4 there is no impact on blood compatibility at their respective IC50 values. The change of size of a multivalent inhibitor could dramatically alter binding affinity to a multivalent target. Here, another factor comes into play. Big globular inhibitors are able to shield a certain area of the binder simply due to size. In line with the scope of this work it was possible to describe steric shielding mathematically and to separate it from the rise of binding affinity due to the multivalent effect.