Funktionelle Bedeutung der UDP-N-Acetylglukosamin 2-Epimerase/N -Acetylmannosamin-Kinase (GNE) für die Anoikis von Tumorzellen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die funktionelle Relevanz des Sialinsäuremetabolismus für die Manifestierung von Anoikis in Tumorzellen evaluiert. Voruntersuchungen an der Pankreaskarzinom-Zelllinie Capan-1 ergaben, dass eine Tumor-spezifische Resistenz gegenüber dieser Spezialform von Apoptose durch die stabile Reexpression des Zellzyklusinhibitors p16INK4a revertierbar ist. Dieser Effekt war mit einer umfassenden posttranslationalen Modifizierung der Kohlenhydratzusammensetzung der Zellmembran verbunden. Über unterschiedliche Microarray-Technologien konnten die Veränderungen im Gesamt- Transkriptom p16INK4a-transfizierter Capan-1 Zellen in dieser Arbeit erstmals mit einer prominenten Minderexpression des bifunktionalen Schlüsselenzyms der Sialinsäurebiosynthese UDP-N-Acetylglukosamin 2-Epimerase/N-Acetylmannosamin- Kinase (GNE) in Zusammenhang gebracht werden. Dieser Befund wurde anhand quantitativer Real-Time PCR bestätigt und korrelierte mit deutlicher Hyposialylierung membranständiger Glykokonjugate. Die transkriptionelle Repression war nicht auf epigenetisches Silencing durch DNA-Methylierung zurückzuführen. Durch selektiven Knock-Down der GNE in Capan-1 Zellen konnte die wesentliche Bedeutung reduzierter Enzymexpression für die Ausbildung des Anoikis-Phänotyps bestätigt werden. Eine gezielte Supprimierung via RNAi durch transiente Transfektion einer spezifischen siRNA-Sequenz resultierte in einer signifikant erhöhten Apoptoserate. Das Transkriptionsprofil, das aus der GeneChip-Analyse GNE-defizienter Capan-1 Zellen (siRNA-, p16INK4a- Transfektanden) gegen entsprechende Kontrollzellen abgeleitet wurde, konnte dies weiter erhärten. Die identifizierten, molekularen Marker ließen einen eindeutigen Bezug reduzierten GNE-Vorkommens auf die Induktion Zelltod- relevanter Prozesse erkennen und verdeutlichten eine spezifische Involvierung in die pro-apoptotisch ausgerichtete Effektorantwort im Rahmen der Unfolded Protein Response (UPR) bei ER-Stress. Mittels TaqMan-PCR konnte das Microarray-basierte Regulationsmuster der ausgewählten Gene belegt werden. Überdies verwies ein in silico Abgleich der GNE-assoziierten Gensignatur darauf, dass ein erhöhtes Transkriptionsniveau der GNE ein allgemeines Merkmal von Krebszellen, v.a. des Pankreas-Adenokarzinoms, darstellt und eine Reduzierung zu einer verminderten Tumorigenität beitragen könnte. Insgesamt leisten die vorliegenden Ergebnisse einen wesentlichen Beitrag zur erweiterten Charakterisierung des Funktionsspektrums der GNE und liefern darüber hinaus möglicherweise eine Grundlage für die Erschließung einer effektiveren Behandlungsstrategie des Pankreas-Adenokarzinoms.

This thesis analyzes the functional impact of sialic acid metabolism on acquisition of anoikis in tumor cells. Previous studies had revealed that stable transfection of tumor suppressor p16INK4a reverses resistance to this special form of apoptosis in pancreatic carcinoma cells Capan-1. Moreover, this effect was accompanied by extensive post-translational modifications in terms of carbohydrate composition of the cell membrane. In this study, the global gene expression pattern of p16INK4a-transfected Capan-1 cells was examined using different microarray technologies from Affymetrix. The data demonstrated for the first time a prominent as well as significant transcriptional reduction of UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase (GNE) – the bifunctional key enzyme of sialic acid biosynthesis – in these transfectants. This finding was confirmed by quantitative real-time PCR. According to the relevance of GNE for synthesis of most terminal monosaccharides, the impairment of enzyme activity correlated with distinct hyposialylation of p16INK4a transfectants. However, the transcriptional repression was not due to epigenetic silencing by DNA methylation. In line with that, target-specific knock-down of GNE with a siRNA-approach resulted in an enhanced anoikis rate, suggesting a fundamental role of the protein in determination of cell fate. The genome-wide transcriptional profile of GNE-deficient Capan-1 cells (siRNA- and p16INK4a-transfectants) in comparison to corresponding control cells supported this result. Apart from a correlation between decreased GNE- expression and apoptotic processes, the identified molecular markers pointed to a clear functional relation of GNE to the pro-apoptotic response of the so- called Unfolded Protein Response (UPR) induced by ER stress. The microarray- derived regulation pattern of the selected candidate genes was validated by quantitative real-time PCR. Furthermore, in silico comparison of the detected gene signature to published cancer-specific microarray data indicated a physiological influence of GNE on the malignant phenotype, especially that of pancreatic adenocarcinoma, implicating a potential reduction of tumorigenicity by transcriptional diminution. These observations provide a substantial contribution to the functional characterization of the enzyme GNE. Additionally, the obtained molecular insights into the basic regulation mechanims of anoikis may promote the development of more effective therapeutic approaches for pancreatic cancer.