Entwicklung, Optimierung und Anwendung einer effizienten analytischen Methode zur Bestimmung von Carotinoiden aus Bakterien und Hefen

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung einer analytischen Methode zur Bestimmung mikrobieller Carotinoide aus photosynthetisch-inaktiven Bakterien und Hefen sowie in der Anwendung der etablierten Methode. Die Methodenentwicklung beinhaltete drei Schwerpunkte: Der erste Schwerpunkt war die Entwicklung eines leistungsstarken Zellaufschlussverfahrens im Halbmikromaßstab. Dazu wurde eine Kombination aus enzymatischen, mechanischen und chemischen Aufschlussmethoden verwendet, wodurch ein breites Spektrum an Carotinoiden aus verschiedensten mikrobiellen Zellstrukturen der nachfolgenden Extraktion zugänglich gemacht wurde. Der zweite Schwerpunkt lag auf der Entwicklung des Extraktionsverfahrens, mit welchem mikrobielle Carotinoide nach dem Zellaufschluss einerseits erschöpfend, andererseits möglichst schonend d.h., unter Vermeidung von Artefaktbildung, Degradation und adsorptiven Verlusten, gewonnen werden können. Der dritte Schwerpunkt lag auf der Entwicklung einer robusten und effizienten chromatographischen Trennmethode. Diese konnte durch die Verwendung einer RP-C30-Phase, durch die Entwicklung spezieller Gradienten und durch die Optimierung der Fließmittelgeschwindigkeit, der Säulentemperatur sowie durch den Einsatz eines Fließmittel-Additivs realisiert werden. Zur abschließenden Beurteilung der gesamten Methode wurden geeignete Leistungsparameter wie Linearitätsbereich, Präzision, Wiederfindung sowie die Nachweis- und Bestimmungsgrenze ermittelt. Nach der Methodenentwicklung folgten drei Anwendungen des etablierten Verfahrens: Die erste Anwendung war ein Screening verschiedenster Bakterien, Hefen und zweier Pilz-Arten. Bei der zweiten Anwendung der Methode wurden anhand der Ergebnisse der Screeningversuche ausgewählte Bakterien und Hefen über ein Basis-Wachstumsmedium gezielt mit verschiedenen Additiven supplementiert. Die Ergebnisse der Carotinoidgehalte und der Carotinoid- Spektren zeigten, dass neben der Steigerung auch eine Lenkung der Carotinoidbiosynthese durch definierte Supplemente möglich ist. Bei der dritten Anwendung diente das etablierte Verfahren als Basis zur Entwicklung einer weiterführenden LC MS Methode, welche für die Charakterisierung von strukturell bekannten, aber auch von strukturell unbekannten mikrobiellen Carotinoiden entwickelt wurde. Zusammenfassend ließ sich feststellen, dass die etablierte Methode effizient und für die aufgezeigten Anwendungen adäquat verwendbar war.

Due to recent scientific research, the uses of carotenoids have found increasing application in the fields of medicine, biotechnology and food chemistry. However advanced research has only yet begun and a lot still has to be established, especially regarding microbiological carotenoids. Consequently there is a need for a robust and sensitive measuring technique for microbial carotenoids. The aim of this publication is therefore to present the development of a method for the determination of carotenoids as well as three subsequent applications of the established method. For the development of the analysis method, emphasis was laid on three focuses: Firstly a robust and practicable cell disruption procedure was developed. This demand could be met by a combination of enzymatic, mechanical and chemical cell disruption techniques. The second focus lay on the development of robust extraction procedures, by which microbial carotenoids could be extracted exhaustively. The third focus lay on the development of an efficient chromatographic method, to realize the separation of the resulting carotenoid extracts. This could be achieved by the use of a RP C30 stationary phase, the development of elution gradients, by the optimization of the flow rate and the column temperature, as well as the application of a mobile phase additive. For the evaluation of the established method, parameters for their validation, such as the range of linearity, precision and the recovery rates were determined, as well as the limit of detection and the limit of quantification. The method developed was used for three purposes: The first application was a screening of different bacteria, yeasts and two types of fungi. With the second application the effects of more than 20 different nutrients added to a basic growth medium were examined. Obtained results demonstrate that by supplying certain supplements to the growth medium, a considerable increase in the yield of carotenoids, as well as an effect on the carotenoid biosynthesis is possible. With the third application, the established method served as a starting point for a LC‑MS method. Apart from examining the molar mass and fragmentation patterns of known carotenoids, the method was modified for the structural characterization of yet unknown carotenoids. Currently little is known about the structure and function of many microbiologic carotenoids. Evidently, more research in the field of microbiologic colorants and dyes will widen the spectrum of known carotenoids. This will also open the door for the biochemical use and exploitation in other areas of medicine. Furthermore, using microorganisms, carotenoids could be synthesized in an economical way. This work has thus laid some foundation for the analysis of microbial carotenoids.