Charakterisierung des Transient-Rezeptor-Potential-Kationenkanals TRPV4 in Insulin-produzierenden INS-1-Zellen

Abstract

Einleitung: Der TRPV4-Kanal ist ein Mitglied der Familie der Transient- Rezeptor-Potential-Kanäle (TRP-Kanäle), einer Gruppe nicht-selektiver Kationenkanäle, die in verschiedenen Organen exprimiert werden. Der TRPV4-Kanal ist osmo- und thermosensitiv. Frühere Studien haben gezeigt, dass pankreatische β-Zellen neben TRPV4 auch andere TRP-Kanäle (TRPC1, TRPC4, TRPC6 und TRPM2-5) exprimieren. Insgesamt ist die Funktion der TRP-Kanäle in pankreatischen β-Zellen jedoch nahezu unbekannt. Bisher konnte lediglich in einer einzigen Studie an einer Maus-β-Zelllinie (MIN6) die Rolle des TRPV4-Kanals als Vermittler der durch humanes Insel-Amyloid-Polypeptid (hIAPP) -induzierten intrazellulären Kalziumakkumulation definiert werden. Allerdings stellt sich die Frage, ob die Vermittlung der hIAPP-induzierten intrazellulären Kalziumakkumulation die einzige Rolle des TRPV4-Kanals in pankreatischen β-Zellen darstellt. Daher wurden funktionelle Untersuchungen des TRPV4-Kanals in einer pankreatischen β-Zelllinie der Ratte durchgeführt zur Charakterisierung dessen weiterer Eigenschaften. Methoden: Der TRPV4-Kanal wurde mittels RT-PCR auf RNS-Ebene in einer pankreatischen β-Zelllinie der Ratte (INS-1) nachgewiesen. Auf Proteinebene wurde TRPV4 mittels Western Blot detektiert. Die TRPV4-Proteinproduktion in INS-1-Zellen wurde mittels Zielgen- spezifischer siRNS reduziert, um die Funktionalität dieses Kanals zu untersuchen. INS-1-Zellen mit regelrechter endogener Expression des TRPV4-Kanals und Zellen mit reduzierter TRPV4-Proteinproduktion wurden Hyperthermie, Hypoosmolarität sowie pharmakologischen Aktivatoren und Inhibitoren des TRPV4-Kanals sowie Modulatoren anderer TRP-Kanäle ausgesetzt. Die Regulation der intrazellulären Kalziumkonzentration und Insulinsekretion durch die oben genannten Modulatoren der TRP-Kanäle wurde ebenfalls untersucht. Ergebnisse: TRPV4 wurde sowohl auf RNS- als auch auf Proteinebene in INS-1-Zellen detektiert. Hyperthermie (circa 50 °C) induzierte einen irreversiblen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Bei moderater Hyperthermie (circa 27,5 °C) war ebenfalls ein Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration nachweisbar. In INS-1-Zellen mit TRPV4-Proteinproduktion reduziert um 71,3% wurde der Hyperthermie-induzierte Kalziumanstieg nicht mehr detektiert. Hypoosmolarität (145 mosm/l) bewirkte einen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, der durch EGTA-vermittelte extrazelluläre Kalziumdepletion, sowie durch den TRP-Blocker Ruthenium Red reduziert werden konnte. Der spezifische TRPV4-Aktivator 4α-PDD sorgte ebenfalls für einen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, der durch extrazelluläre Kalziumdepletion sowie den Ionenkanalblocker Lanthan(III)-chlorid reduziert werden konnte. Aktivierung des TRPV4-Kanals mit 4α-PDD stimulierte die Insulinsekretion bei hoher Glukosekonzentration (16,7 mM), jedoch nicht bei niedriger (2,8 mM) Glukosekonzentration. In INS-1-Zellen mit verminderter TRPV4-Proteinproduktion konnte hingegen kein Anstieg der Insulinsekretion nach Inkubation mit dem TRPV4-Aktivator 4α-PDD in Anwesenheit von 16,7 mM Glukose registriert werden. Zusammenfassung/Schlussfolgerung: In dieser Arbeit konnte der funktionell aktive TRPV4-Kanal in pankreatischen Ratten-β-Zellen (INS-1) auf mRNS- und Proteinebene detektiert werden. Aktivierung des TRPV4-Kanals führte zum Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in INS-1-Zellen. Als Folge der TRPV4-Aktivierung wurde die Glukose-stimulierte Insulinsekretion der β-Zellen potenziert. Eine Fehlfunktion pankreatischer β-Zellen kennzeichnet Diabetes mellitus Typ 1 und Typ 2. Es ist möglich, dass die Expression oder Funktionalität des TRPV4-Kanals in pankreatischen β-Zellen beim Diabetes mellitus möglicherweise gestört ist.

Introduction: The TRPV4 channel is a member of the superfamily of transient receptor potential channels (TRP channels), a group of non-selective cation channels that are expressed in numerous tissues. TRPV4 channel is osmo- and thermosensitive. Earlier studies showed that β-cells express several TRP channels: TRPC1, TRPC4, TRPC6 and TRPM2-5, in addition to TRPV4. Little is known about the functional relevance of TRP channels in pancreatic β-cells. To date, there is only one study available, showing a functional relevance of TRPV4 in mediating human islet amyloid polypeptide (hIAPP) increase of intracellular calcium concentration in a mouse pancreatic β-cell line (MIN6). Therefore, we asked the question whether the increase of intracellular calcium in response to hIAPP treatment is the only function of TRPV4 in pancreatic β-cells. To address this question the expression and function of TRPV4 was studied in pancreatic INS-1 β-cell line. Methods: TRPV4 mRNA expression and protein production in INS-1 cells were detected by RT-PCR or Western Blot, respectively. For analyses of TRPV4 functions, TRPV4 protein production was suppressed by 71.3% using siRNA technique. INS-1 cells with normal endogenous TRPV4 expression and cells with down-regulated TRPV4 protein production were exposed to hyperthermia, hypoosmolarity or were treated with pharmacological activators and/or inhibitors of TRPV4 or other TRP channel modulators. The effects of these stimuli and inhibitors of TRP channels on intracellular calcium concentration and insulin secretion were examined. Results: TRPV4 was detectable on RNA and protein level in INS-1 cells. Calcium imaging showed an irreversible increase of intracellular calcium concentration caused by hyperthermia (circa 50 °C). At moderate hyperthermia (circa 27.5 °C) an increase of intracellular calcium concentration was also detectable. In cells with TRPV4 protein levels down-regulated by 71.3%, moderate hyperthermia failed to increase intracellular calcium concentration. Hypoosmolarity (145 mosm/l) caused an increase of intracellular calcium concentration that could be reduced by EGTA-mediated extracellular calcium depletion and by a TRP blocker, ruthenium red. 4α-PDD, a specific TRPV4 activator, was also able to increase intracellular calcium concentration in INS-1 cells. This increase could be reduced by extracellular calcium depletion and by an ion channel blocker, lanthanum(III) chloride. 4α-PDD stimulated insulin secretion in INS-1 cells exposed to high glucose concentration (16.7 mM), whereas at low glucose concentration (2.8 mM) 4α-PDD was ineffective. In contrast to INS-1 cells expressing endogenous TRPV4, INS-1 cells with down-regulated TRPV4 protein production didn’t show any increase of insulin secretion while being incubated with 4α-PDD at 16.7 mM glucose. Summary/conclusion: The results of the study show that rat pancreatic INS-1 β-cells express TRPV4 channels. Activation of TRPV4 leads to an increase of intracellular calcium concentration in INS-1 cells. This TRPV4-mediated calcium increase triggers insulin secretion in INS-1 cells incubated with high glucose. Whether TRPV4 plays a role in diabetes mellitus, a disease that is characterized by dysfunction of pancreatic β-cells, remains to be further examined in upcoming studies.