Zur Pathogenese des Marfan-Syndroms: Untersuchung der Matrix- Metalloproteinase-Regulierung nach Stimulierung mit rekombinanten Fibrillin-1-Konstrukten und Untersuchung der Selbstassoziation eines rekombinanten Versikan-Konstruktes

Abstract

Das Marfan-Syndrom (MFS) ist eine relativ häufige hereditäre Störung des Bindegewebes, die durch Mutationen in dem Gen für Fibrillin-1 (FBN1) verursacht wird. Das Fibrillin-1 ist eine Hauptkomponente der 10-12-nm- Mikrofibrillen, die zusammen mit dem Elastin die elastischen Fasern in Geweben wie zum Beispiel der Aorta bilden. Im ersten Teilprojekt dieser Arbeit wurde die Auswirkung von Fibrillin-1-Fragmenten auf die Expression und Proteinregulation der Matrixmetalloproteinase (MMP) Typ 1, 2 und 3 in einem Zellkultursystem geprüft. Einerseits können Mutationen im FBN1 die Anfälligkeit von Fibrillin-1 gegenüber Proteolyse erhöhen; andererseits liegen Literaturberichte vor, die eine erhöhte MMP-Expression und Protein- Fragmentierung in Geweben von MFS-Patienten belegen. Dies legte die Frage nahe, ob Fibrillin-1-Fragmente für die Erhöhung der MMP-Konzentrationen mitverantwortlich sein können, was in anderen biologischen Systemen für Fragmente anderer Matrixproteine, wie zum Beispiel Fibronektin, bereits bekannt war. Es wurden daher verschiedene Fibrillin-1-Konstrukte kloniert, die jeweils das einzige intrgrin-bindende Arginin-Glycin-Asparginsäure (RGD)-Motif des Fibrillin-1 enthalten, und dann in einem eukaryontischen Expressionssystem exprimiert. Dermale Fibroblastenkulturen wurden mit den so gewonnenen Konstrukten inkubiert, um die Expression und Proteinregulation von MMP-1, -2 und -3 mittels quantitativer reverser Transkriptase (RT) Polymerase- Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) und Western-Blot zu messen. Es wurde eine signifikante Erhöhung der Expression und Proteinregulation von MMP-1 und MMP-3 nachgewiesen. In einem weiteren Experiment konnte gezeigt werden, dass ein Fragment, welches das Elastin-binding-protein (EBP)-Erkennungsmotiv Glycin-x-x-Prolin-Glycin (GxxPG) aufweist, die Expression und Proteinregulation von MMP-1 signifikant erhöht. Diese Ergebnisse liefern eine plausible Erklärung für die Erhöhung der MMP- Konzenztrationen in den Geweben von Patienten mit MFS. Im zweiten Teilprojekt wurde ein rekombinantes (Ab-kürzung: r) Versikan-Konstrukt mit der C-Typ- Lektin-Domäne (CLD) des Versikans aus dem Bereich der bereits bekannten Interaktion zwischen Fibrillin-1 und Versikan erzeugt (rCLD). Das Versikan ist ein großes (1-2 x 106kDa) Chondroitinsulfat-Proteoglykan, das mittels Interaktionen mit Hyaluronan (Hyaluronsäure, HA) größere Aggregate bilden und außerdem an eine Reihe von anderen Matrixproteinen, Chemokinen und Zelloberflächenmolekülen binden kann. Nachdem initiale Untersuchungen mittels Gelelektrophorese eine Homodimerbildung nahe legten, konnten wir mittels Blot- Overlay-Assay und Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie nachweisen, dass dieses Fragment eine kalziumabhängige Selbstassoziation eingeht. Die Charakterisierung der Bindungsinteraktionen dieses rekombinanten Versikan- Fragments stellt einen ersten Schritt zum Verständnis der Funktionen der verschiedenen Domänen des Versikans dar.

The Marfan syndrome (MFS), a relatively common autosomal dominant disorder of connective tissue, is caused by mutations in the gene for fibrillin-1 (FBN1). Fibrillin-1 is the main component of the 10- to 12-nm microfibrils that together with elastin form elastic fibers found in tissues such as the aortic media. Recently, FBN1 mutations have been shown to increase the susceptibility of fibrillin-1 to proteolysis in vitro, and other findings suggest that up- regulation of matrix metalloproteinases (MMP), as well as fragmentation of microfibrils, could play a role in the pathogenesis of MFS. In the present work, we have investigated the influence of fibrillin-1 fragments on the expression of MMP-1, MMP-2, and MMP-3 in a cell culture system. Cultured human dermal fibroblasts were incubated with several different recombinant fibrillin-1 fragments. The expression level of MMP-1, MMP-2, and MMP-3, was determined by quantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RT- PCR), and the concentration of the MMP corresponding proteins was estimated by quantitative Western blotting. Our results establish that treatment of cultured human dermal fibroblasts with recombinant fibrillin-1 fragments containing the arginine glycine aspartic acid (RGD) integrin-binding motif of fibrillin-1 induces up-regulation of MMP-1 and MMP-3. Our results suggest the possibility that fibrillin fragments could themselves have pathogenic effects by leading to upregulation of MMPs, which in turn may be involved in the progressive breakdown of microfibrils thought to play a role in MFS. In this study we show that a fibrillin-1 fragment containing a EGFEPG sequence that conforms to a putative GxxPG elastin-binding protein (EBP) consensus sequence upregulates the production of matrix metalloproteinase (MMP)-1 by up to ninefold in a cell culture system. A mutation of the GxxPG consensus sequence site abrogated the effects. These results suggest that fibrillin-1 fragments may regulate MMP-1 expression, and that the dysregulation of MMPs related to fragmentation of fibrillin might contribute to the development of MFS. Versican is a large (1 2 × 106 Da) chondroitin-sulfate proteoglycan that can form large aggregates by means of interaction with hyaluronan and also binds to a series of other extracellular matrix proteins, chemokines and cell- surface molecules. Versican is a multifunctional molecule with roles in cell adhesion, matrix assembly, cell migration and proliferation. Characterization of the binding interactions mediated by the various domains of versican is a first step towards understanding the functions of versican and interacting molecules in the extracellular matrix. In this study we investigated a recombinant construct corresponding to the C-type lectin domain of versican and demonstrated a calcium-dependent self-association of this region by blot overlay and plasmon surface resonance assays. This binding reaction could contribute to the ability of versican to organize formation of the proteoglycan extracellular matrix by inducing binding of individual versican molecules or by modulating binding reactions to other matrix components.