The tumour suppressor protein p14ARF regulates cell cycle checkpoint control and induces cell death

Abstract

The tumour suppressor protein p14ARF is encoded by the human INK4a gene locus and it is known that a mutation of this gene is present in almost half of all cancers. It has been shown that p14ARF plays a unique role in the regulation of cell cycle arrest and apoptosis following oncogenic stress. The aim of this thesis was to investigate the regulation of p14ARF induced cell death. To this end, p53 wild type MCF-7 breast carcinoma cells, which have lost the key executioner caspase-3 and MCF-7 cells stably re-transfected with procaspase-3 were employed. Expression of p14ARF induced a dominant G1 arrest in both caspase-3 deficient mock and caspase-3 re-expressing MCF-7 transfectants, but no cell death. Additional checkpoint abrogation by the kinase inhibitor caffeine was accompanied by loss of cell viability in both caspase-3 and mock transfectants. Regardless of the presence of caspase-3, MCF-7 cells died from the G2 phase of the cell cycle. In caspase-3 proficient MCF-7 cells, p14ARF induced apoptosis (type I cell death) after sensitization with caffeine. This was executed via the mitochondrial pathway as evidenced by a breakdown of the mitochondrial membrane potential, cytochrome c release and caspase activation. In contrast, caspase-3 deficient MCF-7 cells died through a non-apoptotic mechanism that was characterized as autophagy. Inhibition of the DNA damage response by caffeine impaired expression of the CDK inhibitor p21 and this was linked to induction of cell death by p14ARF. Thus, loss of p21 facilitates p14ARF-induced apoptosis in a caspase-3 dependent manner or autophagy in the absence of efficient executioner caspase activation. These data indicate that cell cycle arrest programs interfere with p14ARF-induced apoptosis that strictly depends on caspase-3 and that loss of this executioner caspase facilitates induction of autophagy cell death. The impact of the antiapoptotic Bcl-2 protein on p14ARF-induced apoptosis in combination with caffeine was examined using SW480 cells stably overexpressing Bcl-2 at the endoplasmic reticulum or at the mitochondria. Obtained data clearly showed that only when Bcl-2 was localized at the mitochondria apoptosis was completely blocked. These data provide evidence that after sensitization with caffeine, p14ARF predominantly targets the mitochondria to execute cell death. Another essential objective in this thesis was to propose a new useful tool against radiation resistance MCF-7 cells. Additionally, p14ARF sensitized cells for ionizing irradiation, promoted cell cycle progression, and triggered apoptosis via an entirely caspase-3 dependent pathway.

Das INK4a Gen kodiert für das Suppressorprotein p14ARF, welches in fast der Hälfte aller Tumore mutiert ist. Es wurde gezeigt, dass p14ARF eine wichtige Rolle in der Regulation des Zellzyklusarrestes und der Apoptose spielt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Regulation des p14ARF-induzierten Zelltodes zu untersuchen. Aus diesem Grund wurde eine MCF-7 p53 wildtyp Brustkrebs Zelllinie verwendet, welche keine Effektor Caspase-3 exprimiert, sowie MCF-7 Zellen die stabil mit Caspase-3 retransfiziert wurden. Die Expression von p14ARF induzierte einen G1 Arrest, sowohl in Caspase-3 defizienten als auch in Caspase-3 exprimierenden MCF-7 Transfektanten, jedoch konnte kein Zelltod detektiert werden. Eine zusätzliche Behandlung mit dem Kinase Inhibitor Koffein führte zu einem Verlust der Zellviabilität in den Caspase-3 profizienten als auch defizienten MCF-7 Zellen. Die MCF-7 Zellen starben dabei aus der G2 Phase des Zellzykluses heraus, unabhängig von der Caspase-3 Expression. In Caspase-3 exprimierenden MCF-7 Zellen, induzierte p14ARF, nach Sensibilisierung mit Koffein, Apoptose. Die Vermittlung erfolgte über den mitochondrialen Apoptosesignalweg, detektiert durch den Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials, der Cytochrom c Freisetzung und der Caspaseaktivierung. Im Gegensatz dazu, starben Caspase-3 defiziente MCF-7 Zellen durch einen nicht apoptotischen Mechanismus, welcher als Autophagie charakterisiert werden konnte. Die durch Koffein ausgelöste Hemmung der Zellantwort auf DNA-Schäden verminderte die Expression des CDK Inhibitors p21, was zu einer Zelltodinduktion durch p14ARF führte. Der Verlust von p21 führte zu einer Caspase-3 anhängigen p14ARF-induzierten Apoptose bzw. zu Autophagy in Abwesenheit einer effizienten Caspaseaktivierung durch den Verlust von Caspase-3. Diese Daten zeigen, dass die Beeinflussung des Zellzyklus entscheidend für die p14ARF-induzierte Apoptose ist, welche von der Expression von Caspase-3 abhängig ist. Der Verlust der Caspase-3 führt zu einem Zelltod der durch Autophagie vermittelt wird. Des Weiteren wurde der Einfluss des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 auf die p14ARF-induzierte Apoptose in Kombination mit Koffein in SW480 Zellen untersucht, die stabil Bcl-2 entweder am Endoplasmatischen Retikulum oder an den Mitochondrien exprimieren. Die Ergebnisse zeigten eindeutig, dass die Überexpression von Bcl-2, die p14ARF- induzierte Apoptose komplett hemmt, jedoch nur, wenn Bcl-2 an den Mitochondrien lokalisiert war. Dies legt den Schluss nahe, dass nach Sensibilisierung mit Koffein, p14ARF vorzugsweise über die Mitochondrien Apoptose induziert. Ein weiteres wichtiges Ziel dieser Arbeit war es, neue brauchbare Therapien für bestrahlungsresistente MCF-7 Zellen zu entwickeln. Hier zeigte sich, dass eine Sensitivierung der Zellen für strahlungsinduzierten apoptotischen Zelltod und eine begünstigte Zellzyklusprogression durch p14ARF von Caspase-3 abhängig ist.