Targeting of Skin Antigen-Presenting Cells: a Rationale for Nanoparticle-Based Transcutaneous Vaccination

Abstract

The skin is one of the largest immune organs in the first line of contact with pathogens and is rich in potent antigen-presenting cells (APCs), such as Langerhans cells in the epidermis and dendritic cells (DCs) in the dermis. The abundance and localization of skin APCs and their potent capacity to induce immune responses make the skin an attractive tissue for APC targeting, e.g. by transcutaneous (t.c.) vaccine delivery. In fact, vaccines have been very successful in controlling infectious diseases, but several obstacles remain in their development against pandemic chronic diseases, such as HIV, hepatitis C, or cancer, where cellular immune responses play a crucial role in disease control. The aim of this work was to study novel approaches for APC targeting and vaccination. The first series of investigations focused on proof-of- concept studies for vaccination against basal cell carcinomas (BCCs), the most common type of skin cancer. Genetically predisposed individuals as well as organ transplant recipients under long-term anti-rejection drug therapy are especially prone to BCC development. Non-invasive therapy would substantially improve life quality and disease management for those patients. Because BCCs are characterized by a striking homogeneity and low genetic instability, these tumors present an interesting experimental model for the investigation of tumor vaccination strategies. Haired ptch1+/- mice develop endogenous BCC like tumors after exposure to ultraviolet or ionizing radiation. In our studies we demonstrated that long-term anti-rejection drug administration significantly increased the BCC burden in ptch1+/- mice, which suggests that ptch1+/- mice represent a suitable model to study BCC formation in high risk individuals. Mutational activation of Hedgehog signalling with overexpression of Hedgehog target genes such as Hedgehog-Interacting Protein (Hip) is the pivotal step in BCC development. We defined Hip1 as a tumor-associated protein, and designed recombinant Hip1 peptides for immunization to prevent the development of BCCs in ptch1+/- mice. Immunization with either of two large recombinant Hip polypeptides was well tolerated, induced B and T cell responses, and reduced the number of BCCs despite the self-nature of this protein. We concluded that immunization with proteins specifically upregulated by hedgehog signalling may hold promise as a preventive option for patients destined to develop large numbers of BCCs. The work on tumor vaccination fostered further questions regarding possibilities to optimize conventional vaccination strategies. Facilitating vaccine compound penetration into immunization sites rich in APCs and improved APC targeting would benefit the efficacy of new vaccines in the induction of protective immune responses. Implications of epithelial DCs in CD8 cell cross-priming suggested that vaccination via the t.c. route may be especially relevant in the induction of cellular immune responses. Meanwhile, experimental evidence emerged that antigen adsorption to nanoparticles may further help improve the efficacy of current vaccination strategies. These findings encouraged us to explore the t.c. route of vaccination using nanoparticles and particulate vaccines. We established two complementary experimental models: human skin explants to study particle penetration and translocation directly in human skin, and mouse studies for in vivo imaging of particle trafficking and immunogenicity. We identified the hair follicle as a major penetration pathway for nanoparticles and particulate model vaccines in both model systems and found that the penetration depth into murine hair follicles and human vellus hair follicles depends on the particle size. The key finding in our studies was that solid 40 nm polystyrene particles, after pre-treatment of the skin with cyanoacrylate skin surface stripping (CSSS, human skin explants) or tape stripping (murine skin), not only penetrated deeply into hai9r follicle openings, but also through the hair follicle epithelium into the perifollicular tissue. We were even able to detect topically applied Modified Vaccinia Ankara Virus expressing enhanced Green Fluorescent Protein (MVA-eGFP) in barrier-disrupted murine skin and in draining lymph nodes using in vivo confocal laser scanning microscopy, and to demonstrate the capacity of this t.c. immunization method to generate immune responses after topical application of DNA, protein or virus particles. In a large series of investigations, we further generated important data on the size and proportions of different hair follicle types. We found that hair follicle types in different body regions represent rather homogenous groups, suggesting that hair follicle targeting is feasible also in larger numbers of individuals. Because direct imaging of single nanoparticles was not possible with conventionally used microscopic techniques, we developed protocols for the detection of single particles in human skin by scanning transmission X-ray microscopy. In the future, this technology may also allow for the investigation of particle-tissue interactions. Based on these experimental findings we were able to build a strong rationale for nanoparticle-based t.c. vaccination strategies, and we concluded that inclusion of CSSS, a method which opens hair follicles for penetration without disrupting the epidermis, into such t.c. vaccination protocols is probably crucial. Translation of our ideas into clinical applications was key to the success of this project. We developed a standard operating procedure for t.c. vaccination based on CSSS, and also conducted a pilot study on healthy human volunteers to assess its safety and efficacy. Cyanoacrylate Skin Surface Stripping was well tolerated in all individuals. Transcutaneous vaccination according to our newly established protocol induced both effector CD4 and CD8 T cell responses, whereas i.m. injection induced strong effector CD4 in the absence of CD8 T cells, as assessed by intracellular cytokine staining and tetramer analyses. This is the first demonstration of such differences in quality of the cellular immune responses by different routes of vaccination in humans, and it remains a crucial step in the development of vaccination strategies.

Die Haut gehört zu den größten Immunorganen des Menschen und steht in direktem Kontakt mit der Umwelt und möglichen Pathogenen. Die Dichte und die Lokalisation von Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) machen die Haut zu einem attraktiven Organ für das gezielte Heranbringen von Wirkstoffen, z.B. von Impfstoffen, an das Immunsystem. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung neuartiger Strategien für das Heranbringen von Wirkstoffen an APZ der Haut. Berichte über die Beteiligung von epithelialen dendritischen Zellen an der Kreuzpräsentation von Antigenen und der Induktion von CD8 Zellen weisen darauf hin, dass insbesondere transkutane (t.c.) Impfverfahren relevant für die Induktion von zellulären Im-munantworten sein könnten. Hieraus ergeben sich mögliche Anwendungen zur therapeuti-schen Impfungen bei chronisch viralen Erkrankungen und Tumorerkrankungen. In den ersten Versuchsreihen untersuchten wir am Beispiel von Basalzellkarzinomen (BCC) in ptch1+/-Mäusen Möglichkeiten, Tumorwachstum durch Suppression oder Stimulation des Immunsystems zu beeinflussen. BCC sind die häufigsten Tumoren der Haut und entstehen in besonders hoher Anzahl in genetisch prädisponierten Individuen und in organtransplantierten Patienten. Die Verfügbarkeit von nicht-invasiven, idealer Weise vorbeugenden Therapien würde die Lebensqualität und die Behandlung der Betroffenen wesentlich verbessern. Immun-suppressive Dosen von Medikamenten, die üblicher Weise zur Vermeidung von Transplantat-abstoßung eingesetzt werden, erhöhten die Tumorlast im Mausmodell. Umgekehrt ließ sich die Tumorlast durch Vakzinierung mit rekombinanten Fragmenten des Tumor- Antigens Hed-gehog-Interagierendem Protein (Hip) signifikant reduzieren, so dass eine solche Vakzinierung eine viel versprechende Option für die Behandlung von Hochrisikopatienten sein könnte. Ne-ben dem gezielten Targeting von APZ in ihrer natürlichen Umgebung wie der Haut zeigten Daten verschiedener Gruppen, dass die Adsorption von Antigen an Nanopartikel die Effekti-vität von Impfverfahren zusätzlich verbessern könnte. Ausgehend von diesen Ergebnissen untersuchten wir im Folgenden Möglichkeiten für das Heranbringen Partikel- basierter Impf-stoffe an APZ der Haut. An exzidierter menschlicher Haut und am Mausmodell identifizierten wir den Haarfollikel als hauptsächlichen Penetrationsweg für topisch applizierte Partikel. Eine zentrale Beobachtung war, dass solide 40 nm Polystyrenpartikel nicht nur tief in Haarfollikel- öffnungen, sondern teilweise auch durch das Haarfollikelepithel hindurch in das perifollikulä-re Gewebe penetrierten. Topisch applizierte modifizierte Vakzinia Adenoviruspartikel, die grün fluoreszierendes Protein exprimierten (MVA-eGFP), konnten im Follikelepithel und auch in drainierenden Lymphknoten und der Milz nachgewiesen werden. T.c. Immunisierung gelang mit DNA, Protein und Viruspartikeln, Der Durchführung von CSSS kommt bei der t.c. Vakzinierung mit partikulären Impfstoffen wahrscheinlich eine zentrale Rolle . Ausgehend von den experimentellen Protokollen entwickelten wir eine Standardprozedur zur t.c. Vakzi-nierung und führten eine Pilotstudie an gesunden Probanden durch, in der wir die Sicherheit und Effektivität dieses neu entwickelten Impfverfahrens mit Hilfe eines kommerziell erhältli-chen Grippeimpfstoffs überprüften. CSSS wurde von allen Probanden gut vertragen. Die transkutane Impfung nach dem von uns entwickelten Protokoll induzierte Effektor CD4 und CD8 Zellantworten, während intramuskuläre Injektion deutlich Effektor CD4 T-Zellen, aber keine nachweisbaren CD8 T Zellen induzierte. Diese Daten weisen erstmals darauf hin, dass es in Abhängigkeit vom Weg der Impfstoffapplikation zu Unterschieden in der Qualität von zellulären Immunantworten kommen kann.