KURZDARSTELLUNG Hintergrund: Das Zytokin TNF α spielt eine wichtige Rolle sowohl in physiologischen, als auch in pathologischen Entzündungsreaktionen. CD4 positive T Lymphozyten (T Helferzellen, Th Zellen) repräsentieren eine Hauptgruppe der Zellen, die an der Immunantwort und an Autoimmunerkrankungen wie der Rheumatoiden Arthritis (RA) und Morbus Crohn (M. Crohn) beteiligt sind. Die anti TNF α Behandlung mit Biologika wie Infliximab (Ifx), einem monoklonalen chimären Antikörper, reduzieren die Krankheitsaktivität bei Patienten mit RA, M. Crohn und anderen Autoimmunerkrankungen. Infliximab blockiert nicht nur lösliches TNF α (sTNF α), sondern bindet auch an das auf der Zellwand exprimierte membranständige TNF α (mTNF α). In der vorliegenden Arbeit wurden die in vitro Effekte von Infliximab auf isolierte Th Zellen untersucht. Die untersuchten Outcomeparameter waren der zelluläre Sauerstoffverbrauch, die Zytokinexpression, die Apoptoseinduktion und die Proliferation der Th Zellen. Um mTNF α vermittelte Effekte von Infliximab auf Th Zellen zu untersuchen, wurde zuerst die Expression von mTNF α auf stimulierten und unstimulierten Zellen angesehen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Genexpressionssignaturen von ex vivo isolierten und in vitro mit TNF α behandelten humanen Zellen verglichen mit Genexpressionsmustern von ex vivo isolierten Zellen von Patienten mit rheumatischen Erkrankungen. Methoden: Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) wurden von gesunden Blutspendern gewonnen. MACS (Magnetic Cell Separation) isolierte CD4 positive T Lymphozyten wurden mit oder ohne Infliximab inkubiert. Die Reinheit der Zellpopulation und ihre Viabilität wurden mittels Durchflusszytometrie überprüft. Die mTNF α Expression wurde durch Färbung mit fluoreszenzgekoppeltem Infliximab untersucht. Für den zellulären Sauerstoffverbrauch, der amperometrisch mittels Clark Elektrode gemessen wurde, waren die Zellen entweder PMA/Ionomycin stimuliert oder unstimuliert. Die intrazelluläre Zytokinexpression von IL 2 und IFN γ wurde mittels Durchflusszytometrie in PMA/Ionomycin stimulierten und unstimulierten Zellen gemessen. Die Apoptose wurde nach Annexin V/PJ Färbung durchflusszytometrisch in CD3/CD28 stimulierten und unstimulierten Zellen gemessen. Die Proliferation von CD3/CD28 stimulierten Th Zellen wurde vier Tage nach initialer CFDA SE Färbung (Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester) durchflusszytometrisch gemessen. Aus Literaturdaten wurden durch TNF α in humanen Zellen differentiell exprimierte Gene identifiziert. Diese Gene wurden mit Genen verglichen, die in einer anderen Untersuchung beschrieben wurden. Sie werden in Monozyten von Patienten mit einer rheumatischen Erkrankung differentiell exprimiert. Die untersuchten rheumatischen Erkrankungen waren Rheumatoide Arthritis (RA), Systemischer Lupus erythematodes (SLE), Osteoarthritis (OA) und Ankylosierende Spondylitis (AS). Ergebnisse: mTNF α wurde auf CD3/CD28 stimulierten, aber nicht auf unstimulierten Th Zellen exprimiert. Obwohl mTNF α 72 h nach der Stimulation auf 12% der Zellen gemessen wurde, konnte kein Effekt von Infliximab auf CD4 positive T Zellen gefunden werden. Keiner der untersuchten Outcomeparameter veränderte sich, in stimulierten oder unstimulierten Zellen. Weder Veränderungen des Sauerstoffverbrauches, der intrazellulären Zytokinkonzentrationen (IL 2, IFN γ), der Anzahl der apoptotischen Zellen, noch der Proliferationseigenschaften konnten beobachtet werden. Bei den durch TNF α regulierten Genen aus den Literaturdaten und den durch rheumatische Krankheiten differentiell exprimierten Genen finden sich zahlreiche Übereinstimmungen. Von den übereinstimmenden Genen wurden die 22 Gene ausgewählt, die in mehr als einem Artikel erwähnt waren. Unter diesen 22 übereinstimmenden Genen fanden sich viele, deren Proteine bei wichtigen Signalübertragungsprozessen eine Rolle spielen, wie NFκB, STAT 1 und NFκBIA. Schlussfolgerung: Obwohl stimulierte Th Zellen mTNF α exprimieren und Infliximab an das membranständige TNF α bindet, finden sich in vitro keine Effekte von Infliximab auf CD4 positive T Zellen. Die aktuelle Literatur und die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass ein wesentlicher Infliximab Effekt in der Normalisierung von krankheitsbedingten Veränderungen in den Immunzellen von Patienten besteht. So normalisieren sich durch Autoimmunerkrankungen veränderte Zelleigenschaften nach Gabe von Ifx, wie zum Beispiel in der Literatur beschriebene veränderte Apoptoseeigenschaften. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass normale periphere Th Zellen gesunder Blutspender ihre Apoptoseeigenschaften nach in vitro Inkubation mit Ifx nicht verändern. TNF α Wirkungen werden in Gensignaturen von Monozyten von Patienten mit entzündlichen Erkrankungen erkennbar. Bei dem Vergleich der Genexpressionssignaturen von TNF α und inflammatorischen Erkrankungen zeigen sich zahlreiche übereinstimmende Gene. Es konnte gezeigt werden, dass TNF α eine systemische Signatur im peripheren Blut hinterlässt, obwohl sich die Entzündungen bei Autoimmunerkrankungen wie RA zumeist lokalisiert in den Gelenken ausprägen. Diese Signatur zeigt entzündungsrelevante Genexpressionsmuster.
ABSTRACT Background: The cytokine TNF α plays an important role in the physiological and pathological inflammatory reaction. CD4 positive T lymphocytes represent a major fraction of the cell population involved in the immune response and in the pathophysiology of diseases like Rheumatoid Arthritis (RA) and M. Crohn. Anti tumor necrosis factor α treatment with biologicals such as Infliximab (Ifx), a chimeric monoclonal antibody, has been shown to reduce disease activity in RA, M. Crohn and other autoimmune diseases. Infliximab does not only block soluble TNF α (sTNF α) but also binds to the membrane-bound precursor form of TNF α, called membrane TNF α (mTNF α). Objectives: In this study, we have investigated the in vitro effects of Infliximab on highly purified human CD4 positive T cells (Th cells). The examined outcome parameters were cellular oxygen consumption, cytokine expression and the induction of apoptosis and proliferation of Th cells. To find out whether effects of Ifx on Th cells are due to interaction with mTNF α, we studied the mTNF α expression of stimulated and unstimulated Th cells. In the second part we compared gene expression patterns in human cells. We matched differential gene expression patterns of both human cells isolated ex vivo and stimulated with TNF-alpha in vitro with monocytes isolated ex vivo from patients with rheumatic disorders. Methods: Mononuclear cells of the peripheral blood were obtained from healthy donors. MACS (Magnetic cell separation) isolated CD4 positive T lymphocytes were incubated with or without Infliximab. Viability and pureness of the cells was determined by flow cytometry analysis. The expression of mTNF α was quantified by staining with Infliximab coupled to fluorescent dye and flow cytometry analysis. For the cellular oxygen consumption, determined amperometrically with a Clark type electrode, the cells were either stimulated by PMA/Ionomycin or unstimulated. Intracellular cytokine expression levels (IL 2, IFN γ) of Th- cells stimulated by PMA/Ionomycin and unstimulated were measured by flow cytometry. Apoptosis rate was determined by flow cytometry after Annexin V/PI staining of CD3/CD28 stimulated and unstimulated cells. Proliferation of CD3/CD28 stimulated Th cells was measured 4 days after an initial CFDA SE (Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester) staining by flow cytometry. A list was compiled of genes published as being differentially expressed after TNF α stimulation of human cells. These gene expression patterns were matched with disease regulated genes in monocytes from another survey. The rheumatic diseases investigated in this survey were Rheumatoid Arthritis (RA), Systemic Lupus erythematodes (SLE), Osteoarthritis (OA) and Ankylosing Spondylitis (AS) . Results: mTNF α was expressed on CD3/CD28 stimulated CD4 positive T cells, but mTNF α expression was not found in unstimulated Th cells. Although mTNF α was expressed on up to 12% of cells at 72 h after stimulation, we could not find any significant effect of Infliximab on Th cells. None of the assayed outcome parameters changed in stimulated or unstimulated Th cells. Neither changes in oxygen consumption, intracellular cytokine levels of IFN γ and IL 2, number of apoptotic cells, nor the proliferation properties could be observed. There were numerous concurrent TNF α and disease regulated genes. Out of the concurrent genes we selected 22 genes, that were cited in more than one article. Many of these 22 genes play important roles in signaling processes like NFκB, STAT 1 and NFκBIA. Conclusions: Although stimulated Th cells express mTNF α and Infliximab binds to mTNF α there is no in vitro effect of Ifx on Th cells concerning the cytokine expression, apoptosis, proliferation and oxygen consumption. The current literature and the results of this thesis indicate that an essential mechanism of Ifx action is to normalize disease induced changes in immune cells of patients in vivo. It is described by various authors that changes caused by inflammatory diseases, for example altered apoptosis properties were normalized after treatment with Ifx. In this study it could be shown that normal peripheral Th cells of healthy donors do not change their apoptosis properties after in vitro incubation with Ifx. TNF α regulated gene expression patterns are similar to those seen in patients with inflammatory disorders. Comparing the gene expression patterns of TNF α and inflammatory diseases, there are numerous concurrent genes. It could be shown that TNF α leaves a systemic signature in the peripheral blood as if the inflammation in autoimmune disorders like RA is mostly developed locally in the involved joints. This TNF α signature resembles inflammation relevant gene expression patterns.
