dc.contributor.author
Lux, Wolfram
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:08:34Z
dc.date.available
2001-11-05T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7456
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11655
dc.description
0\. Titelblatt
1\. Abstract
2\. Inhaltsverzeichnis
3\. Abbildungsverzeichnis
4\. Tabellenverzeichnis
5\. Abkürzungsverzeichnis
6\. Einleitung
7\. Material und Methoden
7.1 Material und Chemikalien
7.2 Zellbiologische Methoden
7.3 Molekularbiologische Methoden
7.4 Ribonuklease Protektions Assay (RPA)
7.5 DNasel Hypersensitivitätsassay
7.6 In vivo Footprinting
8\. Ergebnisse
8.1 Neurotrophine als Mediatoren der tPA Genexpression
8.2 Analyse des tPA Gens auf genomischer Ebene
8.3 Phorbolester induziert tPA über ein NF-kB responsives DNA-Element
9\. Diskussion
9.1 Experimentelle Methodik
9.2 Neurotrophine regulieren die tPA Transkription
9.3 Eine funktionelle NF-kB Erkennungssequenz reguliert die Transkription von
tPA
9.4 Erkennungssequenzen multipler Transkriptionsfaktoren
Zusammenfassung
Literaturverzeichnis
Danksagung
Veröffentlichungen und Vorträge
Anhang
</FONT
dc.description.abstract
Der Gewebe-Typ Plasminogenaktivator (tPA) ist eine Serinprotease, der neben
seiner bekannten Rolle im fibrinolytischen System auch als wichtiger Mediator
von kognitiven Prozessen erkannt worden ist. Ein Verständnis der Rolle von tPA
in der Regulation der neuronalen Plastizität (z. B. der Remodellierung von
Synapsen), der neuronalen Degeneration und der Erinnerungsbildung (long-term
potentiation) erfordert die Untersuchung der Genregulation im Nervengewebe.
Diesbezüglich liegen bis dato nur wenige in vitro Daten und keinerlei in vivo
Daten vor. Neurotrophine regulieren die Expression von tPA in Abhängigkeit von
Zeit und Dosis. Eine 2,4-2,5fache EC50 induzierte bei NGF (Nerve Growth
Factor, 100 ng/ml) nach 48 h einen 4fachen steady-state Level der mRNA
Expression, während die Neurotrophine BDNF (Brain Derived Neutrophic Factor, 5
ng/ml) und NT-4 (Neurotrophin 4, 25 ng/ml) hingegen schon jeweils nach 4 h ein
um ~5fach erhöhtes Expressionsniveau induzierten, das nach etwa 8 h wieder auf
den ursprünglichen Wert absank. NT-3 (Neurotrophin 3, 5 ng/ml) zeigte
keinerlei Effekte. Die beobachteten Induktionseffekte waren unabhängig von
einer de novo Proteinsynthese und nicht auf eine Veränderungen in der mRNA
Stabilität zurückzuführen. Eine für die Stimulation der Transkription
verantwortliche Promotorregion konnte in Transaktivierungsassays nicht
identifiziert werden. Die in vivo Untersuchung des tPA-Gens in den
Neuroblastom-Zelllinien (SK-N-SH, SNB-19, KELLY) zeigte DNaseI hypersensitive
Bereiche im Promotor (bis zu ?3.6 kb, bis zu ?5.3 kb untersucht), dem ersten
und dem dritten Intron. Die detaillierte Untersuchung der DNaseI
hypersensitiven Bereiche im Promotor mittels der in vivo Footprinting-Analyse
ergab 46 geschützte responsive DNA-Bereiche, die mit 28 bekannten
Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren (Sequenzähnlichkeit >90 %)
korrespondieren. Des weiteren wurden 27 geschützte DNA-Regionen von wenigen
Basen Länge identifiziert, die mit keinen bekannten Bindungsstellen
korrelieren (Sequenzähnlichkeit >90 %). Viele der identifizierten cis-aktiven
DNA-Elemente (z. B. AP1, SP1, NFAT, NF-?B etc.) sind bereits in einen Kontext
mit Differenzierungsprozessen gestellt worden und stützen die publizierten
Befunde einer Mitwirkung von tPA an diesen Vorgängen. Eine fast perfekte NF-?B
Erkennungssequenz (91-100 % Sequenzidentität zu den NF-?B/Rel-Familie
Erkennungssequenzen) ~3,1 kb oberhalb des Transkriptionsstarts wurde in
Reportergenvektoren kloniert, mutiert und als Enhancer der tPA Transkription
identifiziert. Sie ist verantwortlich für eine 11-13fache Induktion durch
Phorbolester (PMA) im neuronalen Gewebe.
de
dc.description.abstract
Tissue-type plasminogen activator (tPA) is a serine protease which catalyzes
the conversion of plasminogen to plasmin within the fibrinolytic pathway to
aid with blood clot dissolution. As a protease it is also necessary for
processes in development (e. g. embryogenesis) and in cellular migration such
as tumor outgrowth and metastasis. Recent studies have implicated tPA in
neuronal plasticity, synaptic remodelling and neuronal degeneration. TPA is
widely expressed in the CNS and neuronal aktivity induces the expression of
mRNA of tPA in pyramidal neurons. Transgenic mice overexpressing tPA show an
increased and prolonged hippocampal long-term potentiation (LTP) and improved
performance in spatial orientation learning tasks while tPA-/- mutants exhibit
learning deficits, retarded neuronal migration and resistance towards neuronal
destruction by injections of excitotoxins. In MS brain tPA is thought to be
responsible for the final enzyme-mediated process of demyelination. A better
untestanding of the role of tPA in cognitive processes requires detailed
examination of its regulation. No in vivo data and only few in vitro data
could be gained regarding the control of neuronal expression of tPA until the
beginning of this thesis.. In neuronal cells (SY5Y, SK-N-SH) neurotrophins
induced the expression of mRNA of tPA in a dose and time dependent manner as
shown by Ribonuclease Protection Assays (RPA) and Transactivation Assays. At
2.4 to 2.5 EC50 NGF (100 ng/ml) stimulated tPA expression 4fold after 48 h
whereas BDNF (5 ng/ml) and NT-4 (25 ng/ml) stimulatd tPA expression ~5fold
after 4 h. NT-3 (5 ng/ml) showed no effect at all. Neither of these effects
was based on enhanced mRNA stability nor dependent of de novo protein
synthesis. In vivo genomic analysis of the whole tPA gene in neuronal tissue
(Kelly, SNB-19, SK-N-SH) exhibited DNaseI HS sites in the promotor region, 1st
and 3rd intron. This promotor region was of further interest for this thesis.
DNaseI HS sites spanning a region of ~3.6 kb in the promotor were investigated
by in vivo footprinting and revealed 46 protected responsive sites towards 28
known transcription factors and 27 protected DNA elements of unknown protein
factors (all based on matrix and core similarity >90%). Many of these factors
are known to play roles in processes of development. One NF-?B responsive
element at ~3.1 kb upstream of the transcription start site was further
investigated. It bears an almost perfect consensus sequence for the NF-?B/Rel
family of protein factors (91-100 % similarity) and shows enhancer properties
in Transactivation Assays. Cloning into reporter-gene-vectors and site
directed mutagenesis identified this element as being responsible for a very
strong response to phorbolester (PMA) of 11-13 fold overnight in neuronal
cells.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
plasminogen tpa neuronal transcription expression footprint DNase
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Regulation der tPA Genexpression in neuronalen Zellen des Menschen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Ferdinand Hucho
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Peter Donner
dc.date.accepted
2001-10-12
dc.date.embargoEnd
2001-11-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2001002126
dc.title.translated
Regulation of tPA genexpression in human neuronal cells
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000000539
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2001/212/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000539
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open access