Untersuchung des 16S-23S rDNA Spacers der Gattung Nocardia und seine Bedeutung für die Speziesidentifizierung mittels gattungsspezifischer PCR und Restriktionsfragmentlängen – Polymorphismus

Abstract

Die Identifizierung von Nocardien sowohl auf Gattungs- als auch Speziesebene ist zur Diagnosestellung und für die Vorhersage der Antibiotikaempfindlichkeit von medizinischer Bedeutung. Insbesondere durch den Anstieg von Nocardiainfektionen in den letzten Jahren und die steigende Anzahl neuer Spezies benötigt die Diagnostik sichere und schnelle Methoden zur Differenzierung dieser potentiellen Krankheitserreger. Konventionelle mikrobiologische Verfahren erwiesen sich dafür als nicht geeignet. Für 63 Stämme aus 26 anerkannten Spezies der Gattung Nocardia wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die komplette 16S rDNA bestimmt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden etliche Stämme reklassifiziert und die Spezies N. pseudovaccinii neu beschrieben. Der 16S-23S rDNA Spacer wurde auf seine Eignung zur Gattungs- und Speziesidentifikation analysiert. Dazu wurden 131Spacersequenzen von 22 Spezies der Gattung Nocardia ermittelt. Bei der Analyse der Sequenzdaten konnte eine sehr hohe Interoperonvariabilität festgestellt werden. Bis zu vier unterschiedliche Operons mit einer Abweichung von bis zu 49,6% in der Primärstruktur konnten für einen Stamm gefunden werden. Das im Rahmen der Arbeit entwickelte Primerpaar Sp3 / Sp4 wurde an 128 Nocardien und 256 Stämmen aus 16 nah verwandten Gattungen evaluiert. Während alle Nocardien von den neuen Primern amplifiziert wurden, fiel die PCR bei allen anderen untersuchten Gattungen negativ aus. Anhand der gewonnenen Sequenzdaten wurden Restriktionsenzyme ausgewählt, die für die Entwicklung eines RFLP-Schemas basierend auf dem PCR Amplifikat geeignet erschienen. Unter Einsatz der Enzyme MvaI, MspI, DdeI und HaeIII gelang es, alle Spezies der Gattung Nocardia eindeutig zu identifizieren. Durch die entwickelten gattungsspezifischen Primer Sp3 / Sp4 in Kombination mit der RFLP- Analyse wird ein leistungsstarkes, präzises, zeit- und kostensparendes diagnostisches Verfahren zur Identifikation von Nocardien bis zur Spezies- oder gar Subspezies-Ebene für das Routinelabor ohne die Notwendigkeit einer kostenintensiver Sequenzierung zur Verfügung gestellt.

The identification of Nocardia both on the genus level and the species level is of medical importance. Especially with the rise of Nocardia infections in recent years and the increasing number of new species, safe and rapid diagnostic methods are needed to differentiate between these potential pathogens. In this context, microbiological methods of detection proved to be unsuitable for it. For 63 strains out of 26 recognized species of the genus Nocardia, the complete 16S rDNA was determined. Based on these results, some strains were reclassified. The 16S-23S rDNA spacer was analyzed concerning its suitability for the genus and species identification. In this context 131 16S- 23S rDNA spacer sequences out of 22 species of the genus Nocardia were determined. The analysis of the sequence data showed a very high interoperon variability. Up to four different operons with a deviation of up to 49.6% in the primary structure could be found for one strain. The primers Sp3 / Sp4 were evaluated with regard to 128 Nocardia strains and 256 closely related genera. While all Nocardia were amplified by the new primers, PCR was negative for all the other species tested. With the help of the sequence data, restriction enzymes that seemed suitable for the development of an RFLP scheme were selected. A RFLP with the enzymes MvaI, MspI, DdeI und HaeIII were able to clearly identify all species. By the developed genus-specific primer Sp3 / Sp4 in combination with RFLP analysis, a powerful, precise, time-and cost- saving diagnostic procedure for the identification of Nocardia to the species or even subspecies level for the routine laboratory is now available without the need for expensive sequencing.