dc.contributor.author
Schatz, Christoph
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:07:42Z
dc.date.available
2003-10-23T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7425
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11624
dc.description
Title page and contents
Abbreviations 5
1\. Summary 1
2\. Introduction 9
3\. Results 39
4\. Discussion 84
5\. Material&Methods; 98
6\. Bibliography 115
dc.description.abstract
During each cell division a cell needs to distribute the genetic material
equally to two daughter cells. To segregate chromosomes the cell uses a
macromolecular machine, the mitotic bipolar spindle. A bipolar spindle forms
also in vitro, when chromosomes are added to Xenopus M-phase egg extract. The
small GTPase Ran has been demonstrated to be necessary for chromatin induced
microtubule (MT) assembly and sufficient to induce microtubule nucleation
(Carazo-Salas et al., 2001; Wilde et al., 2001). The mechanistic details of
Ran's function in microtubule assembly however were unknown. The aim of this
study was to identify the targets of Ran in mitotic spindle assembly and to
characterize their function and regulation. It is shown here that the action
of Ran in spindle formation requires the microtubule associated protein TPX2.
TPX2 is necessary for chromatin to assemble microtubules and induces
microtubule assembly in Xenopus M-phase extract. We show that TPX2 is directly
regulated by importin α first characterized as an adaptor molecule for protein
nuclear import. The site for interaction of TPX2 with importin α is mapped. A
TPX2 mutant that cannot bind importin α is shown to be constitutively active
in the induction of microtubule-containing aster-like structures in Xenopus
egg extract, demonstrating that no other importin α or RanGTPase target is
required to mediate microtubule assembly in this system. Further, recombinant
TPX2 is shown to induce the formation and bundling of microtubules in dilute
solutions of pure tubulin. In this purified system, importin α prevents
TPX2-induced microtubule formation, but not TPX2-tubulin interaction or
microtubule bundling. This demonstrates that the critical early function in
spindle formation regulated by importin α is TPX2-mediated microtubule
nucleation. It was shown that RanGTP also leads to an increase of microtubule
nucleation by spermcentrosomes in mitotic egg extracts. We demonstrate that
TPX2 is necessary for Ran-mediated activation of centrosomes and that this
process is inhibited by importin α. Taken together the presented data reveal
an additional function of components of the nucleocytoplasmic transport
machinery, that of regulating components required specifically during mitosis.
We postulate a general mechanism by which proteins that function in M phase
can be inactivated during interphase by sequestering them from their target
molecules by import into the nucleus. During mitosis, after the nuclear
envelope has been disassembled, TPX2 is inhibited by the import adaptor
molecule importin α. In the vicinity of chromatin where the concentration of
Ran GTP is high TPX2 will be active. In this way Ran will signal spatial
information concerning where the DNA is located.
de
dc.description.abstract
Während jeder Zellteilung muß die Erbinformation gleichmäßig auf die beiden
Tochterzellen verteilt werden. Um die Chromosomen akurat zu verteilen,
bedienen sich die Zellen einer komplexen molekularen Maschinerie, der
Mitotischen Spindel. Die Vorgänge der Zellteilung und Assemblierung einer
Spindel können im Reagenzglas nachgebildet werden. Werden Chromosomen in einem
in vitro System zu einem M-Phase Xenopus Extrakt gegeben bildet sich eine
bipolare Spindel um die Chromosomen. Es wurde gezeigt, daß die kleine GTPase
Ran notwendig für die Assemblierung einer Spindel um Chromosomen ist und
außerdem hinreichend ist, um Mikrotubuli zu nukleieren. Die mechanistischen
Details dieses Prozesses waren aber bislang unbekannt. Ziel dieser Arbeit ist
es, die direkten Effektormoleküle von Ran bei der Bildung der Mitotischen
Spindel zu identifizieren und die Mechanismen ihrer Funktion und Regulation
genau zu charakterisieren. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß Ran für seine
Funtktion bei der Assemblierung der Mitotischen Spindel das Protein TPX2
benötigt. TPX2 ist notwendig für die Nukleation von Mikrotubuli um Chromatin
und für die Induktion der Assemblierung asterartiger Strukturen in Xenopus
M-Phase Extrakt. Wir zeigen hier, daß TPX2 direkt von Importin α, einem
Adaptormolekül für den Import von Proteinen in den Zellkern, reguliert ist.
Die Bindungsstelle des TPX2 Moleküls an Importin α ist identifiziert worden
und ein mutantes TPX2 Molekül hergestellt worden, welches nicht mehr an
Importin α binden kann. Diese TPX2 Mutante ist konstitutiv aktiv bezüglich der
Induktion von mikrotubuli-haltigen, asterartigen Strukturen in Xenopus M-Phase
Extrakten. Dies beweist, daß TPX2 und kein anderes Zielmolekül von Importin α
oder Ran außer TPX2 notwendig für die Assemblierung von Mikrotubuli in diesem
System ist. Weiterhin wird gezeigt, daß TPX2 in einem minimalen System mit
Puffer, TPX2 und Tubulin in der Lage ist, Mikrotubuli zu assemblieren und zu
bündeln. In diesem gereinigten System verhindert Importin α die Nukleation von
Mikrotubuli durch TPX2 aber nicht die Bindung von TPX2 an Mikrotubuli oder das
Bündeln von Mikrotubuli. Diese Daten belegen, daß der kritische von Importin α
regulierte Schritt während der Spindelassemblierung die Nukleation von
Mikrotubuli durch TPX2 ist. In früheren Arbeiten ist gezeigt worden, daß Ran
GTP zu einer vermehrten Nukleation von Mikrotubuli durch Zentrosomen führt.
Wir zeigen hier, daß TPX2 notwendig für die Ran vermittelte Aktivierung von
Zentrosomen ist und daß Importin α diesen Prozeß inhibiert. Zusammengefaßt
zeigen die hier präsentierten Daten, daß die Moleküle, die den Transport in
und aus dem Zellkern ausführen ebenfalls eine Rolle bei der Zellteilung
während der Mitose spielen. Wir schlagen einen allgemeinen Mechanismus vor
nach dem Proteine, die eine Funktion während der Mitose haben, während der
Interphase durch Transport in den Zellkern inaktiviert werden können. Während
der Mitose, nachdem sich der Zellkern aufgelöst hat, wird TPX2 von dem
Adaptormolekül für den Kernimport, Importin α, inaktiviert. In der
unmittelbaren Umgebung des Chromatins, wo die Konzentration von Ran GTP hoch
ist, ist TPX2 nicht an Importin α gebunden und dadurch aktiv. Auf diesem Wege
vermittelt das Protein Ran anderen Zellbausteinen eine Information über den
Aufenthaltsort der DNA.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Mitotic spindle
dc.subject
nuclear cytoplasmic transport
dc.subject
Importin alpha
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
The role of the small GTPase Ran during assembly of a mitotic spindle
dc.contributor.firstReferee
Dr. Iain Mattaj
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Ralf Erdmann
dc.date.accepted
2003-05-12
dc.date.embargoEnd
2003-10-29
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2003002628
dc.title.translated
Die Funktion der kleinen GTPase Ran bei der Assemblierung einer mitotischen
Spindel
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001096
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2003/262/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001096
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access