Functional assessment of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor’s (GEP- NET) sensitivity to bio- and chemotherapeutic drugs and the role of survivin and aurora kinase B expression in GEP-NET disease

Abstract

Gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors (GEP-NETs) are poorly understood lesions that encompass a broad category of neoplasms derived from neuroendocrine cells of the gastrointestinal mucosa and the pancreas. The lesions are grouped based on the acceptance that they have a common cell lineage and produce similar secretory products. Although the overall 5-year survival rate for all carcinoids is 67.2 %, most of the undifferentiated neuroendocrine tumors are presented with evidence of extensive disease and less than 8 % are alive after 2 years. Treatment possibilities of GEP-NETs are still not satisfactory and novel therapeutic options are much needed. The present study is based on experiments with BON and QGP-1 cell lines presented as cell models for well-differentiated neuroendocrine tumor (WDET) and well- differentiated neuroendocrine cancer (WDEC) disease, respectively. Moreover, on the basis of expression of neuroendocrine markers we propose that the MIP-101 cell line could be used as a cell model for poorly-differentiated neuroendocrine cancer (PDEC) disease. In the current study we report that the somatostatin analogue octreotide could induce growth inhibitory effects, when used in combination with the aurora kinases blocking agent ZM447439. QGP-1 and MIP-101 cell lines were extremely sensitive to doxorubicin and SN-38 with IC50 values in the nanomolar range. We propose that SN-38 might be considered as a very good option in the treatment of aggressive WDEC and PDEC disease. MIP-101 cells were moderate sensitive to 5-FU and cisplatin, but not to oxaliplatin. However, incubation of GEP-NET cell lines with streptozocin, oxaliplatin and etoposid induced growth inhibition at µM-mM concentrations. In the present work we are suggesting a basically new approach in the treatment of GEP-NET disease – targeting the Chromosome Passenger Complex members survivin and aurora kinase B. We proved for the first time that the survivin main splice variants are expressed in the GEP-NET cells compartments in a unique manner. We showed that it is possible to reduce markedly the expression of the cytoprotective factor survivin in human GEP-NET cancer cells by survivin targeted siRNAs. ZM447439, a potent selective aurora kinases inhibitor reduced the growth of GEP-NET cell lines in a time- and dose-dependent manner inducing cell cycle arrest and accumulation of cells with 4N DNA content. The addition of ZM447439 to the DNA-intercalating agents streptozocin, cisplatin and especially doxorubicin, had a profound supra-additive effect to the inhibition of tumor cell growth. The combination of sub-IC50 concentrations of ZM447439 and DNA-intercalating cytotoxic agents could be extremely valuable in the practice, allowing achievement of a good therapeutic effect at a low level of adverse reactions to either agent. ZM447439 induced also overexpression or downregulation of aurora kinase B depending on the cell type. Intriguingly, aurora kinase B downregulation was almost always followed by survivin downregulation and the modulation of aurora kinase B seems to be a possible mechanism for dynamic regulation of survivin. In the current work we also provide preliminary data of a pilot study that serum survivin levels could be used as a biomarker of disease activity in GEP-NET patients. Here, as well as in patients with solid tumors and hematological malignancies, we found pronounced differences in serum levels of survivin depending on the tumor burden and the probability of circulating tumor cells. However, extensive studies are needed in the future.

Gastroenteropankreatische neuroendokrine Tumoren (GEP-NETs) bilden eine sehr heterogene Gruppe von Neoplasien, die aus neuroendokrinen Zellen der Mukosa des Gastrointestinaltraktes und des Pankreas hervorgehen. Diese Läsionen werden eingeteilt nach Lokalisation (Vorderdarm, Mitteldarm, Hinterdarm), Differenzierung, Funktionalität und Größe; alle Faktoren zusammen bestimmen das Malignitätspotential der Tumore. Obwohl die 5-Jahres-Überlebensrate bei gut differenzierten neuroendokrinen Karzinomen 67.2 % beträgt, ist der einzelne Krankheitsverlauf nur schwer vorhersagbar, und die therapeutischen Möglichkeiten für GEP-NETs sind begrenzt. Hier sind dringend bessere und für den einzelnen Patienten passgenauere Therapien notwendig. Diese Arbeit basiert auf Experimenten mit BON – und QGP-1 Zellkulturen, die ein Modell für gut differenzierte neuroendokrine Tumore (WDET) bzw. für gut differenzierte neuroendokrine Karzinome (WDEC) darstellen. Wir schlagen auf der Basis des Nachweises typischer neuroendokriner Marker die Zelllinie MIP-101 als Modell für ein schlecht differenziertes neuroendokrines Karzinom (PDEC) vor. In dieser Arbeit untersuchen wir zunächst den Einfluss verschiedener in der Klinik verwendeter Bio- und Chemotherapeutika auf das Wachstum der o.g. Tumorzellinien und die zugrunde liegenden funktionellen Mechanismen wie z.B. den Einfluss auf die Apoptose und Zellzyklus-Regulation. Z.B. sind QGP-1 und MIP 101 Zelllinien extrem sensitiv gegenüber Doxorubicin und SN-38 mit IC50- Werten im nanomolaren Bereich. Wir schlagen daher vor, dass SN-38 (bzw. Irinotecan) eine sehr gute Behandlungsoption bei aggressiven WDEC und PDEC darstellen könnte. Die MIP-101 Zellen sind zudem gegenüber 5-FU und Cispaltin empfindlich, aber nicht gegenüber Oxaliplatin. Aufgrund unserer Vorarbeiten zur prognostischen Bedeutung des anti-apoptotisch wirkenden und mitose- fördernden Proteins Survivin bei GEP-NET Patienten interessiert uns in dieser Arbeit sowohl die funktionelle Bedeutung von Survivin als auch seines Partner- Proteins im sog. „Chromosomalen Passenger Komplex“, Aurora Kinase B. Hier können wir nun erste Ergebnisse zur funktionellen Herunter-Regulation sowohl von Survivin (durch spezifische siRNA) bei den o.g. Zelllinien als auch zur pharmakologischen Inhibition von Aurora Kinase B durch die Substanz ZM447439 präsentieren. ZM447439 reduziert das Wachstum von GEP-NET-Zelllinien zeit- und dosisabhängig durch Induktion von Zellzyklusarrest und Akkumulation von Zellen mit 4N DNA-Gehalt. Zusätzlich vermittelt ZM447438 in Kombination mit bereits bekannten Bio- und Chemotherapeutika supra-additive Effekte. So können wir zeigen, dass das Somatostatin-Analogon Octreotid in Kombination mit ZM447439 tatsächlich gering antiproliferativ in BON Zellen wirken kann. Die Gabe von ZM447439 zu den DNA-interkalierenden Agenzien Streptozocin, Cisplatin und besonders Doxorubicin zeigt einen besonders ausgeprägten supra-additiven Effekt auf das Wachstum von QGP-1 und MIP- 101 Tumorzellen. Die Kombination von sub-IC50 Konzentrationen dieser Kombinationen könnte in der Praxis extrem wertvoll sein durch gute therapeutische Effekte bei weniger Nebenwirkungen. In unserer Arbeit bieten wir auch erste Daten einer Pilotstudie an, die zeigen, dass die Konzentration von Survivin im Serum als Biomarker für die Erkrankungsaktivität bei GEP-NET Patienten dienen kann. Hier, genau wie bei hämatologischen und soliden malignen Tumoren, sehen wir ausgeprägte Unterschiede in der Serumkonzentration von Survivin abhängig von der Tumorlast und wahrscheinlich zirkulierenden Tumorzellen. Diese präliminären Ergebnisse sollten in einer klinischen Studie weiter untersucht werden.