dc.contributor.author
Fiedler, Janine
dc.date.accessioned
2018-06-07T20:57:56Z
dc.date.available
2012-09-26T11:20:55.025Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7203
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11402
dc.description
Danksagung Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Hämatopoese 1.2
Megakaryopoese und Thrombopoese 1.2.1 Differenzierung der HSC zum Thrombozyt
1.2.2 TPO-induzierte Megakaryopoese 1.2.2.1 TPO und sein Rezeptor c-Mpl
1.2.2.2 TPO-induzierte Signaltransduktion reguliert die Megakaryopoese 1.2.3
TPO-unabhängige Regulation der Megakaryopoese und Thrombopoese 1.3 Angeborene
Thrombozytopenien 1.4 TAR-Syndrom 1.4.1 Symptome, Phänotyp und Kenntnisstand
1.4.2 Genetische Ursachen 1.5 Zielsetzung der Arbeit 2 Material und Methoden
2.1 Material 2.1.1 Chemikalien 2.1.2 Antikörper (Ak) 2.2 Häufig verwendete
Puffer 2.3 Oligonukleotide der Mikrodeletionsgene 2.4 Zellkultur 2.4.1
Lymphoblastoide Zelllinien 2.4.2 Differenzierung von HSCs zu Megakaryozyten
2.5 Biochemische Untersuchungen 2.5.1 Analyse der TPO-induzierten
Signaltransduktion 2.5.1.1 Probenaufbereitung: Isolation und Stimulation der
Thrombozyten 2.5.1.2 Phosphorylierungsstudien der Signalmoleküle – Immunblot
2.5.1.3 Electrophoretic mobility shift Assay (EMSA) 2.5.2 Enzyme linked
Immunosorbent Assay (ELISA) 2.6 Molekularbiologische Arbeiten 2.6.1 DNA-
Isolation aus mononukleären Zellen 2.6.2 RNA-Isolation 2.6.3 Reverse
Transkription der RNA in cDNA 2.6.4 Genexpressionsanalyse mittels qRT-PCR
2.6.4.1 Kinetik der qRT-PCR und Bestimmung des CT-Werts 2.6.4.2
Reaktionsbedingungen der qRT-PCR 2.6.4.3 Bestimmung der
Amplifikationseffizienz 2.6.4.4 Relative Quantifizierung mittels CT-Methode
2.7 Durchflusszytometrie 2.8 Densitometrie 2.9 Statistische Auswertungen 3
Ergebnisse 3.1 Zeitliche Verläufe der Thrombozytenwerte bei TAR-Patienten 3.2
Zwei Muster TPO-induzierter Signaltransduktion in Thrombozyten von TAR-
Patienten 3.2.1 Keine TPO-induzierte Phosphorylierung von Jak2 in Thrombozyten
von TAR-Patienten unter 18 Jahren 3.2.2 Gestörter Jak/STAT-Signalweg bei TAR-
Patienten mit Muster #1 3.2.3 Jak2 ist die Schlüsselkinase der TPO-abhängigen
Signalweiterleitung 3.2.4 Thrombozyten von TAR-Patienten mit Muster #1 weisen
leicht reduziertes c-Mpl auf 3.3 Der prozentuale Anteil unreifer Thrombozyten
(IPF%) ist bei TAR-Patienten mit Muster #2 nicht erhöht 3.4 Normale
Plasmaspiegel von SDF-1 und FGF-4 bei TAR-Patienten 3.5 Beitrag der
Mikrodeletion zur Thrombozytopenie im TAR-Syndrom 3.5.1 Unauffällige TPO-
induzierte Signaltransduktion in Thrombozyten von Eltern mit und ohne
Mikrodeletion 3.5.2 Unauffällige mRNA-Expression der Mikrodeletionsgene in
LCLs 3.5.3 Hämojuvelin-Nachweis in Thrombozyten von TAR-Patienten 3.5.4
PIAS3-Nachweis in Thrombozyten von TAR-Patienten 3.6 „Modifier of TAR” –
Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) in RBM8A 3.6.1 SNP in RBM8A 3.6.2
Ecotropic viral insertion-1 (Evi-1) bindet an RBM8A-Sequenz mit 5´-UTR-SNP
3.6.3 In Thrombozyten von TAR-Patienten wird eine reduzierte Proteinmenge von
Y14 detektiert 4 Diskussion 4.1 Periphere Blutwerte der TAR-Patienten 4.2
Kopplung zwischen TPO-induzierter Signaltransduktion und Thrombozytenbiogenese
4.2.1 Zwei Muster TPO-induzierter Jak/STAT-Signaltransduktion in TAR-Patienten
4.2.2 Jak2 ist die Schlüsselkinase der TPO-induzierten Signaltransduktion
4.2.3 Trotz TPO-induzierter Signaltransduktion haben Patienten mit Muster #2
keine normalen Thrombozytenzahlen 4.2.4 TPO-Rezeptor c-Mpl 4.2.5 TPO-
Rekativität in Thrombozyten als Surrogat für das Maß der Megakaryopoese 4.2.6
TPO-unabhängige Thrombozytenbiogenese 4.3 Funktionsdefekt der Thrombozyten von
TAR-Patienten 4.4 Mausmodelle für das TAR-Syndrom 4.5 Genetische Aspekte des
TAR-Syndroms 4.5.1 Analyse von PIAS3 und Hämojuvelin in Thrombozyten 4.5.2
Analyse der Mikrodeletionsgene in LCLs 4.5.3 „Modifier of TAR“ – SNP in RBM8A
4.6 Ausblick 5 Zusammenfassung 6 Abstract 7 Anhang – Charakteristika der TAR-
Patienten und Übersicht der Phosphorylierungs- und SNP-Studien 8
Literaturverzeichnis Eidesstattliche Erklärung Lebenslauf Publikationen
dc.description.abstract
Thrombozyten sind zellulärer Bestandteil des Blutes und essentiell für die
primäre Hämostase. Das Thrombocytopenia-absent radii (TAR)-Syndrom ist eine
seltene angeborene Erkrankung, die durch Mangel an Thombozyten
(Thrombozytopenie) und Radiusaplasie gekennzeichnet ist. Die Mehrheit der TAR-
Patienten zeigte nach den ersten zwei Lebensjahren einen Anstieg der
Thrombozytenzahlen auf, bei einem Viertel waren diese zum Teil noch als
Erwachsene anhaltend niedrig. Alle Patienten weisen eine Mikrodeletion auf
Chromosom 1q21 auf. Zu 75% wird diese von einem gesunden Elternteil vererbt.
Somit ist die Deletion zur Ausprägung des TAR-Syndroms notwendig, aber nicht
ausreichend. Die molekularen Ursachen der Erkrankung sind bislang kaum
verstanden. In dieser Arbeit wurde die Thrombopoietin (TPO)-induzierte
Signaltransduktion in Thrombozyten von TAR-Patienten für ein besseres
Verständnis der Thrombozytenbiogenese charakterisiert. In zwölf TAR-Patienten
unter 18 Jahren mit sehr geringen Thrombozytenzahlen wurde eine defekte TPO-
induzierte Signaltransduktion des Jak/STAT-, PI3K/Akt- und Raf/Erk-Signalwegs
in Thrombozyten nachgewiesen (Muster #1). Ursächlich dafür ist die nicht
phosphorylierbare Januskinase 2. Diese konnte erstmals ex vivo als
Schlüsselkinase der TPO-induzierten Signaltransduktion bestätigt werden. Elf
TAR-Patienten über 18 Jahren zeigten eine unauffällige TPO-induzierte
Signaltransduktion (Muster #2). Trotzdem weisen diese Patienten
Thrombozytenzahlen unterhalb des Referenzbereichs auf. In gesunden
Elternteilen der TAR-Patienten (mit und ohne Mikrodeletion) wurde in den
Thrombozyten eine unauffällige TPO-induzierte Signaltransduktion detektiert.
Somit hat die Mikrodeletion allein keinen negativen Einfluss auf die
Thrombozytenbiogenese. In der vorliegenden Arbeit konnte außerdem gezeigt
werden, dass c-Mpl (der Rezeptor für TPO) in Thrombozyten von TAR-Patienten
mit Muster #1 etwas reduziert war, was ebenfalls zur verminderten Reaktivität
der TPO-induzierten Signaltransduktion beitragen kann. Da aber Patienten mit
Muster #2 und Kontrollpersonen vergleichbare Mengen des Proteins in
Thrombozyten aufweisen, ist eine reduzierte Menge an c-Mpl als Ursache für die
Thrombozytopenie beim TAR-Syndrom unwahrscheinlich. Der Wechsel zwischen
Muster #1 und #2 erfolgt viele Jahre später als der Anstieg der
Thrombozytenzahlen, was eine Entkopplung zwischen TPO-Reaktivität und
Thrombozytenbiogenese beim TAR-Syndrom nahelegt. Mittels Next generation
sequencing wurden in der DNA von TAR-Patienten zwei seltene Einzelnukleotid-
Polymorphismen (SNPs) in regulatorischen Gensequenzen von RNA binding motif
protein 8A (RMB8A), einem Gen innerhalb der Mikrodeletion, identifiziert.
Liegt einer dieser SNPs zusammen mit dem funktionalen Verlust von RBM8A auf
dem anderen Allel vor, so verursachen diese mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit
das TAR-Syndrom. Patienten erhalten einen der beiden SNPs in RBM8A von einem
Elternteil und zu 75% vom anderen Elternteil die Mikrodeletion. Zu 25%
entsteht sie de novo. Durch den SNP im 5´-UTR-Bereich ergibt sich eine
zusätzliche Bindungsstelle für den gewebespezifisch-exprimierten
transkriptionellen Repressor Ecotropic viral insertion 1. In TAR-Patienten ist
die Proteinmenge von RBM8A reduziert. Inwieweit dies zur Thrombozytenbiogenese
(und Radiusaplasie) beiträgt, sollte in Zukunft geklärt werden.
de
dc.description.abstract
Platelets are cellular blood components and essential for primary hemostasis.
Thrombocytopenia-absent radii (TAR)-syndrome ist a rare congenital disorder
with a lack of platelets (thrombocytopenia) and bilaterial radius aplasia.
While most TAR-patients show ameliorated platelet counts within the first two
years of life, about one quart suffers from very low platelet even into
adulthood. All patients harbor a microdeletion on chromosome 1q21. In 75% of
patients the microdeletion is inherited by on healthy parent implying that it
is essential but not sufficient for causing TAR-syndrome. So far, the
molecular causes underlying the disease are ill-defined. In this work the
thrombopoietin (TPO)-induced signaling in platelets was characterized for a
better understanding of regulation of thrombopoiesis in TAR-patients. 12 TAR-
patients under 18 years with very low platelet counts showed a defective TPO-
dependent Jak/STAT-, PI3K/Akt- und Raf/Erk signaling in platelets (pattern
#1). The cause therefor is nonphosphorylatable Januskinase 2. It could be
shown ex vivo that Januskinase 2 is the keyregulator for TPO-induced
signaling. In contrast, inconspicuous TPO-dependent Jak/STAT-, PI3K/Akt- und
Raf/Erk signaling was detected in 11 TAR-patients over 18 years (pattern #2).
Despite normal signaling, these TAR-patients still have low platelet counts.
Parents of the patients (with and without microdeletion) showed normal TPO-
dependent signaling and platelet counts. Thus the microdeletion itself does
not negatively contribute to the platelet production. Patients with pattern #1
show a slightly reduced protein level of the TPO receptor c-Mpl in platelets,
which could contribute to the platelet production defect. However, patients
with pattern #2 and controls have comparable c-Mpl-levels but differ in
platelet production. Thus, a reduced c-Mpl protein level as cause for the TAR-
syndrom is unlikely. The switch from pattern #1 to #2 was observed many years
later than the increase in platelet counts, implying that TPO-reactivity and
platelet production might be uncoupled in TAR syndrome. Via Next generation
sequencing two rare single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the regulatory
gene sequence of RNA binding motif protein 8A (RMB8A), a gene within the
microdeletion, were discovered in all TAR-patients analyzed. One of these SNPs
together with the functional loss of RBM8A on the other allele cause TAR-
syndrome. We could show that the SNP is inherited from one parent while the
microdeletion is inherited to 75% from the other parent and occurs de novo in
25% of patients. In this work I could show that one of the SNPs generates a
new binding site for the tissue specific-expressed transcriptional repressor
Ecotropic viral insertion 1. Patients have reduced expression of RBM8A protein
level in platelets. How far these findings contribute to the thrombocytopenia
(and radius aplasia) in TAR-syndrome should be analyzed in the future.
en
dc.format.extent
105, X S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Thrombopoietin
dc.subject
Signaltransduktion
dc.subject
RNA binding motif protein 8A
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Biochemische und genetische Charakterisierung der Thrombopoietin-induzierten
Signaltransduktion beim Thrombocytopenia-absent radii-Syndrom
dc.contributor.contact
jannerchen@gmx.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Petra Knaus
dc.contributor.furtherReferee
PD Dr. Harald Schulze
dc.date.accepted
2012-09-24
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000039365-7
dc.title.translated
Biochemical and genetic characterization of thrombopoietin signaling in
thrombocytopenia-absent radii syndrome
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000039365
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000012139
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free
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open access