Functional characterisation of the TUP5 gene in Arabidopsis thaliana

Abstract

Arginine is one of 20 standard amino acids necessary for the formation of peptides and proteins. It is also used as a nitrogen storage compound in seeds. Furthermore, arginine is the precursor of polyamines and nitric oxide which play an important role in many developmental processes and the response to various environmental stresses. Plant amino acid pathways have for a long time been mainly deduced from studies in bacteria and fungi. In this work the first conclusive study on an arginine biosynthetic Arabidopsis mutant is described. The EMS mutant tup5-1 (tumor prone 5-1) was found in a screen for Arabidopsis mutants of which hypocotyl and root explants were cultivated on medium containing low auxin and cytokinin concentrations. The phytohormone concentrations were under the threshold of callus induction in the wild type, while the tumor prone mutants produced calli (Riefler, 2001). Furthermore, tup5-1 also has a unique blue light-dependent short root phenotype: The root meristem is lost under blue light irradiation, resulting in root growth stop in the mutant (Frémont, 2004). In the following work, it was shown that the inhibiting light is perceived by the root. The cells constituting this short, growth arrested root have a strongly reduced metabolic activity, but are still viable. The gene encoding TUP5 was identified as an acetylornithine aminotransferase (ACOAT), catalysing the fourth step of arginine biosynthesis. The tup5-1 mutation is located in the third exon of At1g80600 causing an amino acid substitution (G424R). The amino acid targeted by this substitution is conserved in the homologous genes of bacteria, fungi and plants. Consistently, the free arginine content was reduced in tup5-1 compared to the wild type and root growth was restored in the mutant by exogenous supplementation of arginine. As an additional functional proof, a yeast mutant lacking ACOAT which was auxotrophic for arginine could restore its arginine autotrophy after transformation with the Arabidopsis TUP5 cDNA. Microarray data and real-time PCR showed that TUP5 is expressed in rosette leaves, stems, flowers, siliques and roots. Furthermore, TUP5 expression is positively regulated by light. A TUP5-GFP fusion showed that TUP5 is most likely localised in chloroplasts. A knockout of TUP5 is lethal, as was shown for T-DNA insertion alleles. This confirms the crucial role of TUP5 as a single copy gene. The loss of root meristem in tup5-1 might be directly caused by the lack of arginine or by accumulation of other metabolites in toxic amounts, as the amino acid metabolism is more generally deregulated in tup5-1. The mechanisms linking the short root phenotype to arginine deficiency and blue light signalling still have to be elucidated. The mutant tup5-1 provides a link between primary metabolism, plant development and blue light signalling.

Arginin ist eine von 20 proteinogenen Aminosäuren, die für die Bildung von Peptiden und Proteinen benötigt werden. Zusätzlich wird Arginin zur Stickstoffspeicherung in Samen eingelagert und ist außerdem eine Vorstufe von Polyaminen und Stickoxid, die eine wichtige Rolle in Entwicklungsprozessen und bei der Streßantwort auf Umwelteinflüsse spielen. Die Synthesewege von Aminosäuren in Pflanzen wurden lange Zeit vorwiegend von bekannten Stoffwechselwegen aus Bakterien und Pilzen abgeleitet. In der vorliegenden Arbeit wird die erste umfassende Charakterisierung einer Argininbiosynthese- Mutante in Arabidopsis beschrieben. Die EMS-Mutante tup5-1 (tumor prone 5-1) wurde in einem genetischen Hormonsensitivitätsscreen gefunden. Wurzel- und Hypokotylexplantate dieser Mutante bildeten in vitro vermehrt Kalli auf Medium mit geringen Auxin- und Cytokininkonzentrationen (Riefler, 2001). tup5-1 zeigte außerdem eine bisher nicht beschriebene blaulichtabhängige Ausdifferenzierung des Wurzelmeristems, die zum Stop des Wurzelwachstums führte (Frémont, 2004). In der vorliegenden Arbeit wurde die Mutante weiter charakterisiert und die Funktion des betroffenen Gens untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß das inhibierende Licht in der Wurzel perzipiert wird, und daß die Wurzelzellen des ausdifferenzierten Wurzelmeristems in ihrer Stoffwechselaktivität stark eingeschränkt sind. Das Gen, das für TUP5 kodiert, wurde als Acetylornithin-Aminotransferase (ACOAT) identifiziert. Das Enzym katalysiert den vierten Schritt der Arginin-Biosynthese. Die tup5-1 Mutation ist im dritten Exon von At1g80600 lokalisiert und bewirkt eine Aminosäuresubstitution (G424R). Die von dieser Substitution betroffene Aminosäure ist in homologen ACOATs von Bakterien, Pilzen und Pflanzen konserviert. Die aufgrund von Sequenzvergleichen postulierte Funktion von TUP5 in der Argininbiosynthese konnte auf verschiedene Weise bestätigt werden: Zum einen war der Arginingehalt in tup5-1 im Vergleich zu Wildtyp wegen der Störung in der Argininbiosynthese stark reduziert, zum anderen konnte das Wurzelwachstum in der Mutante durch exogene Gabe von Arginin wiederhergestellt werden. Als zusätzlicher funktioneller Nachweis konnte eine Hefe-Mutante, die aufgrund des fehlenden homologen ACOAT-Gens argininauxotroph war, durch Transformation mit der Arabidopsis TUP5 cDNA komplementiert werden. Microarray-Daten und qRT-PCR-Experimente zeigten, daß TUP5 in Rosettenblättern, Sproß, Blüten, Schoten und Wurzeln exprimiert und durch Licht positiv reguliert wird. Durch Untersuchung eines TUP5-GFP- Fusionsproteins in transformierten Protoplasten konnte gezeigt werden, daß TUP5 mit größter Wahrscheinlichkeit in Chloroplasten lokalisiert ist. Die Untersuchung von T-DNA-Insertionslinien ergab, daß sich ein kompletter Verlust der TUP5 Funktion letal auswirkt. Dies bestätigt die überlebenswichtige Rolle von TUP5, von dem nur eine einzige Kopie im Arabidopsis-Genom vorliegt. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Mutante tup5-1 eine bisher unbekannte Verbindung zwischen Primärmetabolismus, Pflanzenentwicklung und Blaulicht-Perzeption in Arabidopsis aufzeigt.