Yersinia enterocolitica ist ein häufiger Durchfallerreger. Um die der Diarrhö und Barrierestörung zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären, wurden die erregerspezifischen Pathomechanismen in einem humanen Kolonkarzinom- Zellkulturmodell detailliert analysiert. Die Infektion der als epithelialer Monolayer wachsenden humanen Kolonkarzinom-Zelllinie HT-29/B6 führte zu einer ausgeprägten Reduktion des transepithelialen Widerstands (Rt, TER) und einer Zunahme der Permeabilität für Mannitol (182 Da) und Fluorescein (332 Da). Der als Kurzschlussstrom gemessene aktive Ionentranport war unverändert. Die Veränderungen erfolgten zeit- und dosisabhängig und konnte nur durch den lebenden Erreger selbst, nicht aber durch bakterielle Kulturüberstände induziert werden. Typische Yersinia-Virulenzfaktoren, wie Invasin oder die Expression des Yersinia-Virulenzplasmids pYV waren nicht ursächlich. Y. enterocolitica induzierte in HT-29/B6-Zellen Nekrosen, was durch eine gesteigerte LDH-Freisetzung nachgewiesen wurde. Apoptosen traten nicht vermehrt auf. Mit Hilfe der Conductance-Scanning-Technik konnten in infizierten Monolayern lokale Leitfähigkeitsänderungen detektiert sowie durch Biotinylierung und anschließende Laserscanning-Mikroskopie visualisiert werden. Innerhalb dieser als leaky regions definierten Bereiche waren die barrierebildenden Claudine 3, 4 und 8 aus der Tight Junction in das Zytoplasma umverteilt. Zusätzlich zeigten Western Blot-Analysen eine verminderte Expression von Claudin-2, -3, -8, -10 und ZO-1. Darüber hinaus konnte eine Regulation der Claudin-8-Expression über die terminale c-Jun-Kinase nachgewiesen werden. Die Inhibition der Kinase bewirkte eine Abschwächung des durch Y. enterocolitica verursachten Rt-Abfalls sowie eine vollständige Wiederherstellung der Proteinexpression von Claudin-8. Somit wird die von Y. enterocolitica induzierte Barrierestörung durch lokale Tight Junction-Defekte und Nekroseinduktion hervorgerufen. Im Gesamtorganismus würden diese Mechanismen einerseits zu einem gesteigerten Übertritt von Antigenen aus dem Lumen in die Blutbahn führen und andererseits einen vermehrten Übertritt von Soluten und Wasser vom Blut ins Lumen verursachen, der zu einer Leckflux- Diarrhö führen kann. Der Escherichia coli-Stamm Nissle 1917 (EcN) kommt seit Jahren als Probiotikum bei der Behandlung von Diarrhöen und inflammatorischen Darmerkrankungen zum Einsatz. Um seine die Barriere stärkenden Mechanismen aufzuklären, wurde in dieser Arbeit der Einfluss des hochwirksamen EcN- Kulturüberstands auf die Tight Junction-mediierte Barrierefunktion in vitro am HT-29/B6-Zellkulturmodell untersucht. Aus EcN-Kulturen präparierte Überstände (EcNK) verursachten eine Verdopplung des Rt und eine Verminderung der Permeabilitäten für Mannitol und NaCl und somit eine Abdichtung der epithelialen Barriere. Das bekanntermaßen immunstimulatorisch wirkende EcN- Flagellin war hierfür nicht verantwortlich. Messungen mittels Zwei-Wege- Impedanzspektroskopie offenbarten insbesondere eine Zunahme des parazellulären Widerstands. Die für verschiedene Tight Junction-Proteine (Occludin, Tricellulin und Claudine sowie das TJ-assoziierte Protein ZO-1) durchgeführten Expressionsanalysen zeigten ausschließlich eine Zunahme der Protein- und mRNA- Level von Claudin-14 durch EcNK. Mittels Hitzeinaktivierung des EcNK konnten die Effekte auf Rt und Claudin-14-Expression aufgehoben werden. Die barriererelevante Funktion des bisher kaum charakterisierten Claudin-14-Proteins bestätigte sich abschließend im siRNA-Transfektionsansatz. Somit ist die im HT-29/B6-Modell durch EcNK induzierte Barriereprotektion auf eine Hochregulation von Claudin-14 zurückzuführen.
Yersinia enterocolitica is a common cause of acute gastroenteritis. In order to clarify the mechanisms leading to diarrhea and barrier dysfunction the pathomechanisms of this infection were studied in detail. Exposure of human colonic HT-29/B6 cells to Y. enterocolitica resulted in a decrease in transepithelial resistance (Rt, TER) with a parallel increase in mannitol (182 Da) and fluorescein (332 Da) permeability. Active ion transport measured as short circuit current was unchanged. The Y. enterocolitica induced changes were time-dependent, required the presence of living bacteria, could not be triggered by bacterial supernatants, and were not due to Yersinia invasin or expression from the virulence plasmid pYV. Concomitantly, Y. enterocolitica induced necrosis as indicated by an increase in LDH-release, while epithelial apoptosis was not upregulated. Local changes in conductivity were detected by conductance scanning, indicating leaky regions within the epithelium which were visualized by biotinylation and confocal laser scanning microscopy. In these regions, sealing claudin-3, -4 and -8 were redistributed off the tight junction into the cytoplasm. In addition, the expression of claudin-2, -3, -8, -10 and ZO-1 was diminished as quantified by immunoblotting. Moreover, claudin-8 protein expression was found to be regulated via the c-Jun N-terminal kinase, the inhibition of which partially prevented the Y. enterocolitica induced decrease in Rt and restored claudin-8 protein level. In conclusion, barrier dysfunction in Y. enterocolitica infection is due to circumscribed epithelial tight junction protein changes and necrotic cell loss. As a consequence leak flux diarrhea and antigen-uptake may be triggered in human infection. Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) is a probiotic bacterium used for the treatment of inflam-matory bowel disorders. To study its barrier strengthening mechanisms the in vitro effect of highly active EcN supernatant (EcNK) on tight junction mediated barrier function was assessed here using the HT-29/B6 cell culture model. EcNK dissected from bacterial culture, improved barrier function measured by a two-fold increase in Rt and a reduction of permeability for mannitol and NaCl. This was not due to flagellin. Measurements by two-path-impedance spectroscopy revealed a strong effect on paracellular resistance. When changes of tight junction proteins as claudins, occludin, tricellulin as well as the scafold protein ZO-1 were examined, claudin-14 was the only one found to be affected by EcNK. Claudin-14 was elevated on protein- and mRNA-level. Heat treatment of active EcNK abolished the increase in Rt and the upregulation of claudin-14 protein level. By silencing claudin-14 in a siRNA-transfection assay, the sealing function of this so far less well characterized tight junction protein was confirmed. In conclusion, EcNK improves barrier function in HT-29/B6 by upregulating claudin-14.
