In der vorliegenden Arbeit sollte eines der Hauptprobleme der heutigen Krebstherapie bei soliden Tumoren, die im Verlauf einer Therapie auftretende Resistenz gegenüber Zytostatika, untersucht werden. Die Aufgabe lag darin, Apoptoseresistenz- und damit Zytostatikaresistenz-regulierende Signalproteine zu identifizieren. Dazu standen zwei zelluläre Modellsysteme aus Zytostatika- sensitiven (MT-1 und MT-3) und resistenten (MT-1/Adr und MT-3/Adr) Mammakarzinom-Zellinien zur Verfügung. Folgende Ergebnisse wurden in den Modellsystemen erzielt: 1\. Der Defekt der MT-1/Adr-Zellen ist mit einer stark erhöhten Bcl-2-Expression verglichen mit den Zytostatika-sensitiven MT-1-Zellen assoziiert. Im Gegensatz dazu wird die Resistenz der MT-3/Adr- Zellen durch die Überexpression des MDR-1/P-Glykoproteins hervorgerufen. 2\. Die beiden Apoptose-fördernden Proteine Bak und Bik/Nbk wurden in den beiden Anthrazyklin-resistenten Zellinien MT-1/Adr und MT-3/Adr stabil überexprimiert. 3\. Die Überexpression von Bik/Nbk sensitivierte MT-1/Adr- Zellen gegenüber Epirubicin- induzierter Apoptose und antagonisierte die Zytostatikaresistenz teilweise. Die Überexpression von Bak führte zur vollständigen Revertierung des resistenten Phänotyps der MT-1/Adr-Zellen. 4\. In den MT-3/Adr-Zellen konnte gezeigt werden, daß die Überexpression von Bak und Bik/Nbk die Sensitivität gegenüber Epirubicin-induzierter Apoptose erhöhte. 5\. Die Überexpression dieser beiden Proteine beeinflußte weder die Zytostatika-aufnahme und -efflux von Epirubicin noch die Expression des Transportproteins MDR-1. 6\. In den chemosensitiveren Transfektanten konnte nach Epirubicinbehandlung eine erhöhte Caspase-3-Aktivierung und ein stärker herabgesetztes mitochondriales Membranpotential nachgewiesen werden. Beide wesentlichen Kontrollpunkte in der Apoptosekaskade sind in den Anthrazyklin- resistenten Zellen defekt. 7\. Durch die Überexpression von Bik/Nbk und Bak konnte die Kreuzresistenz gegenüber Etoposid und Taxol nicht beeinflußt werden. 8\. Daraufhin wurden mögliche Unterschiede in den Signalwegen und Resistenzursachen überprüft. Es konnte kein Unterschied in der Bildung freier Sauerstoffradikale zwischen Epirubicin-sensitiven und ?resistenten Zellen gemessen werden, aber die Etoposid- sensitiven Zellen bildeten deutlich mehr Sauerstoffradikale als die Etoposid-resistenten maternalen Zellen und Transfektanten. 9\. Weiterhin stellte sich die Frage, ob das Apoptose- fördernde Protein Bak auch Thermoresistenz antagonisieren kann. Dazu wurden stabil überexprimierende Bak-Klone in einer thermoresistenten Magenkarzinomzellinie generiert. Es konnte bestätigt werden, daß Hyperthermie Apoptose induziert und daß der Bcl-2-Signalweg daran beteiligt ist. Bak revertiert auch die in diesem System vorliegende Thermoresistenz. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß Bak und Bik/Nbk mögliche Zielproteine für einen gentherapeutischen Ansatz darstellen. Die Untersuchungen, daß die Apoptoseregulation durch Mitglieder der Bcl-2-Familie nicht nur Chemosensitivität sondern auch Resistenzen verschiedener Ursachen wie Chemoresistenz und Thermoresistenz beeinflussen kann, sprechen für die zentrale Bedeutung der Bcl-2-Familie in der Pathogenese des Mammakarzinoms.
Constitutive and acquired resistance to cytostatic drug-induced cell death is the major obstacle for the cure of malignancies. It was therefore interesting to test whether overexpression of death promoting factors can overcome resistance to cytotoxic therapies. Two model systems of drug-sensitive, MT-1 and MT-3, and drug-resistant breast cancer cell lines, MT-1/Adr and MT-3/Adr, were used to investigate whether the pro-apoptotic Bcl-2 homologues Bak or Nbk/Bik can overcome resistance for drug-induced apoptosis. The following results could be achieved: 1\. First, Bak and Nbk/Bik stable transfectants were generated in MT-1/Adr and MT-3/Adr cells. 2\. The defect in the MT-1/Adr cells is associated with strongly increased Bcl-2 expression. In contrast, the MT-3/Adr cells overexpress the Mdr-1/p-glycoprotein and drug resistance is due to an increased detoxification by removal of the drug from the cell by the Mdr-1 ABC transporter. 3\. In the MT-1/Adr cells, the overexpression of Nbk/Bik sensitized the MT-1/Adr cells for epirubicin-induced apoptosis and partially antagonized drug resistance. The overexpression of Bak, however, completely reversed the resistant phenotype in the MT-1/Adr cells and conferred sensitivity to epirubicin-induced apoptosis which was equivalent to the original, drug-sensitive MT-1 cells. In the MT-3/Adr cells, overexpression of both Bak or Nbk/Bik enhanced drug sensitivity for epirubicin-mediated apoptosis as compared with the MT- 3/Adr mock transfectants. In contrast, etoposide- and taxol-mediated apoptosis could not be influenced by overexpression of Bak or Bik/Nbk. This observation has led to investigations of functional differences between epirubicin and etoposide-induced apoptosis. There were no difference in the amount of free reactive oxygen species (ROS) during epirubicin-induced apoptosis between sensitive and resistant cells. Nevertheless, etoposide-sensitive cells produced more ROS than etoposide- resistant maternal cells and the Bak or Bik/Nbk transfectants. 4\. Overexpression of both Bak and Nbk/Bik was capable of reverting the defective mitochondrial activation after exposure to epirubicin. A similar sensitizing effect was observed when caspase-3 activation was analyzed. Both Bak and Nbk/Bik transfectants showed a strong induction of caspase-3 activity when exposed to epirubicin. 5\. In order to investigate whether Bak may also revert resistance against heat-shock (thermoresistance), the protein was stably expressed in the thermoresistant gastric cancer cell line EPG 85/257/T. Measurement of apoptotic DNA fragmentation showed that heat shock induces apoptosis via a bcl-2-sensitive mitochondrial signalling pathway. Thus, the overexpression of Bak could sensitize the thermoresistant cells to heat-shock- induced apoptosis. Altogether, these data show that the manipulation of the downstream apoptosis signalling cascade by the overexpression of Bak or Nbk/Bik can overcome not only drug resistance due to mitochondrial apoptosis deficiency (in the MT-1/Adr cells) but also classical, i.e. efflux-mediated, resistance for drug-induced cell death in the MT-3/Adr cell line. Finally, the fact that both Nbk/Bik and Bak sensitize tumor cells for drug- and heat-shock- induced apoptosis and thereby may overcome resistance suggests that the manipulation of such apoptosis promoting Bcl-2-like proteins might yield a therapeutic strategy to overcome drug resistance in tumors refractory to cytotoxic therapies.
