Der skNAC-Smyd1-Komplex: Ein multifunktioneller Regulator der Myogenese?

Abstract

Die Skelett- und Herzmuskel spezifische Variante der α-Untereinheit des Nascent-associated-complex (skNAC) sowie dessen Interaktionspartner, das SET- umd MYND-Domänen enthaltene Smyd1-Protein werden ausschliesslich im quergestreiften Muskel exprimiert. Beiden Proteinen wird dabei aufgrund im Vorfeld der Arbeit veröffentlichten Publikationen eine entscheidene Rolle bei der Myogenese zugeschrieben. Dabei handelt es sich um einen komplexen und hoch organisierten Prozess, durch den während der Embryonalentwicklung oder auch durch spätere äußere Einflüsse, wie beispielsweise nach Verletzung, differenzierte Muskelfasern, mit streng strukturierten Sarkomeren, entstehen und der durch eine Vielzahl von Proteinen genau zeitlich und räumlich gesteuert wird. Um die implizierten Funktionen von skNAC und Smyd1 im Skelettmuskel sowie deren eigentlichen Mechanismus detaillierter in Säugetieren zu analysieren, wurden in der vorliegenden Arbeit eine Reihe an unterschiedlichen Experimenten durchgeführt. In einem ersten Schritt konnte gezeigt werden, dass skNAC, wie bereits im Vorfeld für Smyd1 demonstriert, auf transkriptioneller Ebene reguliert wird, wobei der p38-Signalweg dabei eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Interessanterweise konnte nach Hemmung der skNAC-Expression in murinen Myoblasten kein Einfluss auf das Differenzierungsverhalten der Zellen nachgewiesen werden, dargestellt durch die Analyse bekannter Differenzierungsmarker auf RNA, als auch auf Proteinebene. Jedoch konnte nach knockdown der skNAC-Expression, ähnlich wie bereits für skNAC und Smyd1 im Zebrafischmodellsystem gezeigt, ein Effekt auf die Sarkomerogense in den verwendeten Säugetierzellen beobachtet werden. Dieser war gekennzeichnet durch eine gestörte Anordnung der dicken (Myosin-) und dünnen (Aktin-) Filamente. Auf der Suche nach dem Mechanismus der für den beobachteten Phänotyp verantwortlich sein könnte, wurde das Expressionsmuster einer Reihe von Chaperonen und Ubiquitin-Ligasen nach Hemmung der skNAC- Expression untersucht, deren Funktionen im Zusammenhang mit der Myofibrillogenese bereits bekannt sind. Dabei konnten das Calpain 1- und 3-Gen als mögliche Kandidaten identifiziert werden. Deren Transkript- als auch Aktivitätslevel waren nach Unterdrückung der skNAC-Expression vor allem für Calpain 1 signifikant erhöht. Eine Behandlung der skNAC-siRNA-transfizierten Zellen mittels eines spezifischen Calpaininhibitors verdeutlichte, dass tatsächlich Calpaine eine Rolle bei den beobachteten Effekten spielen könnten, da die Behandlung dazu führte, dass skNAC-defiziente Zellen nicht mehr von Wildtyp-Zellen zu unterscheiden waren. Da zudem ein Zusammenhang zwischen Calpainen und Migrationsvorgängen bekannt ist, wurde außerdem untersucht, ob möglicherweise auch skNAC-defiziente Zellen ein verändertes Migrationspotential aufweisen. Dies war tatsächlich zu beobachten. Auch in diesem Fall konnte durch die Zugabe des Calpaininhibitors ein Migrationspotential wiederhergestellt werden, dass dem der Kontrollzellen entsprach. Aufgrund vorangegangener Publikationen wird angenommen, dass sowohl skNAC als auch Smyd1 als Transkriptionsfaktoren bzw. zumindest als transkriptionelle Aktivatoren agieren. Bisher konnten diese Annahme jedoch noch nicht eindeutig belegt werden. Ferner sind auch nur wenige spezifischen Targetgene beider Proteine beschrieben. Um potentielle Zielgene von skNAC zu identifizieren, wurde daher ein cDNA-Microarray nach Inhibierung der skNAC- Expression in kultivierten, differenzierenden Myoblasten durchgeführt. Unter den analysierten Genen befanden sich dabei auffällig viele Gene, die vor allem im Kontext mit der Immunantwort bekannt sind. Überraschenderweise konnte das Myoglobin-Gen nicht als differentiell exprimiertes Gen ermittelt werden. Überraschend aufgrund der Tatsache, dass vorherige Studien u.a. darlegen, dass skNAC die Myoglobin-Promotoraktivität stimulieren kann. Insgesamt weisen die in den C2C12-Zellen gewonnen Daten nach Inhibierung der skNAC-Expression, zum Teil kontrovers zu vorherigen Publikationen, darauf hin, dass skNAC die Verschiebung hin zu Fasern mit einem eher glykolytischen Metabolismus fördert. Des Weiteren liefert die Studie erstmals Hinweise darauf, dass als möglicher molekulare Mechanismus, durch den der skNAC-Smyd1-Komplex die Expression spezifischer Gene beeinflusst, Histonmethylierungen und Acetylierungen in Frage kommen könnten. Die bisher dargestellten Daten verdeutlichen, dass skNAC und Smyd1 unterschiedliche Funktionen in der Zelle erfüllen. Auch die Tatsache, dass beide Proteine im Verlauf der Differenzierung eine Translokation aus dem Kern ins Zytosol durchlaufen, untermauert, dass es sich bei diesen vermutlich um multifunktionale Proteine handelt. Über den Mechanismus der die Translokation beider Proteine steuert, war vor Beginn der vorgelegten Studie noch nichts bekannt. Erste Anhaltspunkte wurden dabei durch die Ergebnisse eines Hefe-2-Hybrid-Screens erlangt, bei dem neben anderen potentiellen Interaktionspartnern eine E3-SUMO-Ligase namens Nse2 identifiziert werden konnte. Diese ist Bestandteil eines aus drei enymatischen Schritten bestehenden posttranslationalen Modifizierungsprozesses, welcher als Sumoylierung bezeichnet wird. Eine wichtiger Vorgang in der Zelle, der durch Sumoylierung gesteuert wird, stellt der Transportprozess in und aus dem Zellkern dar. Tatsächlich führte die Unterdrückung der Nse2-Expression, neben Hemmung des Differenzierungspotentials der C2C12-Zellen, zu einem gestörten Transport von Smyd1 und skNAC aus dem Nukleus in das Zytosol. Ein ähnliches Phänomen konnte im weiteren Verlauf auch nach Hemmung der globalen Sumoylierung beobachtet werden. Ferner konnte in der Studie demonstriert werden, dass Smyd1 im Skelettmuskel ein Sumoylierungssubstrat darstellt. Sumoylierung spielt somit vermutlich eine wichtige Rolle bei der Steuerung der nuklearen und zytosolischen Funktionen von skNAC und Smyd1. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand darin, skNAC im Kontext mit muskulären Erkrankungen, speziell im Zusammenhang mit der Pathogenese von Rhabdomyosarkomen, zu untersuchen. Rhabdomyosarkome stellen die häufigsten Weichteiltumore im Kindesalter dar und leiten sich hauptsächlich von entarteten Vorläuferzellen des Muskelgewebes ab. Als Ausgangsmaterial der Studie dienten verschiedene bereits gut charakterisierte Rhabdomyosarkomzelllinien, die sich aufgrund ihres Ursprungs, ihrer genetischen Aberrationen, ihres Differenzierungsverhalten und bezüglich ihrer Malignität unterscheiden lassen. Interessanterweise zeigten die Ergebnisse der Studie zum einen, dass die skNAC-Expression nicht in allen untersuchten Rhabdomyosarkomzellen induziert wird, wie es normalerweise in nichttransformierten Myoblasten der Fall ist. Zum anderen konnten sie darstellen, dass bei solchen Zelllinien, die kein hohes Basallevel an skNAC nach Initiieren des Differenzierungsvorganges aufweisen, ein Einbringen von skNAC zu einer Steigerung des Differenzierungspotentials führt, welches parallel mit einer gehemmten Proliferation einhergeht. Zudem konnte nach Rekonstitution von skNAC ein Verlust der Malignität in solchen Zellen beobachtet werden, ein wichtiger Befund, der möglicherweise einen neuen therapeutischen Ansatz impliziert.

Skeletal and heart muscle-specific variant of the α subunit of nascent polypeptide associated complex (skNAC) and its interaction partner, the SET and MYND domain containing Smyd1 protein are exclusively found in striated muscle cells. Prior to this study, several reports had demonstrated that both proteins regulate myogenesis i.e. the process of new muscle formation, either during embryonic development or in response to injury. Myogenesis is a complex and tightly organized process during which, in response to external stimuli, differentiated muscle fibers with structured sarcomeres develop. The aim of this study was to mechanistically analyze the function of skNAC and Smyd1 in myogenesis. Initially, it was shown that skNAC, like Smyd1 expression, is regulated at the transcriptional level during differentiation of cultured myoblasts, with the p38 MAPK signal transduction pathway playing an important role. However, after inhibition of skNAC expression in these cells, no effect on their differentiation behaviour could be observed. Nevertheless - similar to findings of others in the zebrafish system – it could be demonstrated that knockdown of skNAC expression has an effect on sarcomerogenesis, i.e. the formation and development of new sarcomeres. This effect was characterized by a disturbed assembly of thick (myosin) and thin (actin) filaments in the skNAC-deficient cells. In search of the mechanisms which could be responsible for this phenotype, the expression levels of various genes encoding proteins known to be involved in sarcomerogenesis were analyzed after inhibition of skNAC expression. And indeed, upregulation of calpain 1 and calpain 3 gene expression could be observed after inhibition of skNAC expression. Consistently, treatment of skNAC-knockdown cells with a specific calpain inhibitor revealed that skNAC controls sarcomere architecture in a calpain- dependent manner. Since calpains are known to be potent inducers of myoblast migration, it was furthermore tested whether manipulation of skNAC gene expression affects myoblast migration. This was de facto the case: skNAC- deficient cells were characterized by strongly enhanced myoblast migration rates when compared to control cells, which was - like the effects on sarcomerogenesis - a consequence of the elevated calpain activity seen in these cells. In other previous publications a function of skNAC and Smyd1 as transcription factors or at least as transcriptional co-activators had been suggested prior to this study. However, their mechanism of action in regulating transcription and also probably most of their target genes were largely enigmatic at the beginning of this study. Thus, to identify novel skNAC target genes, we carried out cDNA microarray analysis after inhibiting skNAC expression in cultured, differentiating myoblasts. Remarkably, a high proportion of the differentially expressed genes that were identified corresponded to genes encoding regulators of inflammation. Surprisingly, however, no negative effect on myoglobin gene expression could be observed, although earlier studies had demonstrated that skNAC can stimulate transcription from the myoglobin promoter. Consistently, we also observed upregulation of other genes associated with an oxidative myofiber phenotype in the skNAC-depleted cells. Thus, our data, contradictory to previously published results, indicate that skNAC promotes fiber type changes directed towards a more glycolytic metabolism. In addition, with regard to a potential mechanism of transcriptional control by the skNAC-Smyd1 complex, we provide evidence indicating that the two proteins might modulate histone methylation and histone (de)acetylation patterns in myoblasts. These data suggested that skNAC and Smyd1, potentially as a complex, might act as multifunctional proteins. In addition, the fact that both proteins undergo nuclear-to- cytoplasmic translocation during myogenesis supports the idea that they fulfill specific functions in both subcellular compartments. However, the mechanism that controls this translocation was largely unknown at the beginning of this study. Interestingly it could be shown that skNAC binds to the E3 SUMO ligase Nse2, which was initially identified via a yeast-two-hybrid screen using a C-terminal skNAC fragment as a bait. E3 SUMO ligases catalyze the attachment of a small SUMO protein to a target protein. This post- translational modification, called sumoylation, is known to be involved in various cellular processes, including the regulation of nucleocytoplasmic shuttling. Indeed, knockdown of Nse2 expression in cultured, differentiating myoblasts led to a partial blockade of the nuclear-to cytoplasmic- translocation of the skNAC-Smyd1 complex, accompanied by inhibition of specific aspects of myogenic differentiation. Consistently, a similar effect could be observed after inhibition of global protein sumoylation. In addition, we could show that Smyd1 is a sumoylation substrate in skeletal muscle cells. These data suggest that sumoylation might play an important role in regulating skNAC-Smyd1 functions by controlling the balance between nuclear and cytosolic localization of this protein complex. Finally, another aim of this study was to investigate a potential role of skNAC in skeletal muscle diseases, specifically a possible link between skNAC and the pathogenesis of rhabdomyosarcoma. Rhabdomyosarcoma is the most common sporadic soft-tissue sarcoma of childhood. It is assumed that the respective tumors might originate from mesenchymal stem cells of the myogenic lineage. In this study, selected, well-characterized rhabdomyosarcoma cell lines, which differ in their origin, their genetic aberrations, their differentiation behavior and their metastatic potential, were used to analyze skNAC expression after the induction of myogenic differentiation. Interestingly on the one hand, we could demonstrate that in contrast to normal, non-transformed myoblasts, some of the tested rhabdomyosarcoma cell lines lack inducible skNAC expression. Furthermore, we could show that overexpression of skNAC in specific rhabdomyosarcoma cell lines leads to upregulation of specific myogenic differentiation markers, accompanied by a reduced cell proliferation and a loss of metastatic potential, a finding which might have important therapeutic implications in the future.