Wirkmechanismen von Glucocorticoiden im Knochen und in der Prostata im Mausmodell

Abstract

Die Wirkmechanismen von Glucocorticoiden (GC) im Knochen sowie in der Prostata sind bis dato nicht vollständig verstanden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war – neben der Validierung verschiedener Methoden zur Applikation von GC im Tiermodell – die Bestimmung des Einflusses des Osteoblasten auf die GC Wirkung im Knochen. Darüber hinaus wurde der Einfluss von GC auf Stroma- und Epithelzellen der Prostata charakterisiert. Methoden: Zunächst wurden die technischen Grundlagen zur chronischen Applikation von GC im Mausmodell untersucht. Hierzu wurden repetitive subkutane Injektionen, die Implantation subkutaner osmotischer Pumpen sowie die subkutane Implantation von slow- release Pellets verglichen. Nach Etablierung der optimalen Methodik (slow- release Pellet) folgte eine Serie von in-vivo Experimenten, mittels derer der Effekt von GC auf spezifische Knochenzellen untersucht wurde. Hierbei kamen sog. Col2.3-11ß-HSD2 transgene Mäuse zum Einsatz, bei denen GC auf Prä- Rezeptor-Ebene durch die selektive Überexpression des Enzyms 11ß–Hydroxysteroid–Dehydrogenase Typ 2 (11ß-HSD2) ausschließlich im Osteoblasten inaktiviert werden. Insgesamt wurden 44 Wildtyp und 42 transgene Tiere entweder mit 1,5mg/Woche Corticosteron oder Placebo für 4 Wochen behandelt. Anschließend wurden Tibia und Wirbelsäule mittels Micro-CT, Histologie, Histomorphometrie und Immunohistochemie analysiert. In einem zweiten Ansatz wurden außerdem Prostata, Testes und Vesiculae seminales auf histologischer Ebene untersucht. Ergebnisse: Die Implantation subkutaner slow- release Pellets führte zu einer chronischen und signifikanten Hypercorticosteronaemie in der Maus, wobei zum Erreichen prolongierter Effekte eine wöchentliche Re-Implantation der Pellets notwendig wurde. Wiederholte Injektionen oder die Implantationen GC-haltiger osmotischer Pumpen hatten dagegen keinen nachhaltigen Effekt auf die GC Serum Konzentration der Versuchstiere. Nach 4-wöchiger Behandlung mit GC Pellets konnte in der Tibia von WT Mäusen ein endocorticaler Verlust von Knochen beobachtet werden, jedoch kam es gleichzeitig zu einem pericorticalen Anbau von Knochensubstanz. In den Wirbelkörpern dieser Mäuse wurde dagegen ein Verlust corticaler Knochenmasse festgestellt. Interessanterweise führte die gleiche GC-Behandlung weder in der Tibia noch in der Wirbelsäule von transgenen Tieren zu einem signifikanten Verlust von trabekulärer Knochensubstanz. Nach der GC-Exposition imponierte in der anterioren Prostata (AP) der Maus eine deutliche Dysplasie des Epithels. Gleichzeitig konnte eine deutliche Induktion des GC-Rezeptors im Stroma - nicht aber im Epithel der AP - festgestellt werden. Weiterhin wurde im Stroma der AP eine deutlich erhöhte Expression von potentiell mutagenem Fibroblast Growth Factor (FGF) 2 und 10 als Folge der GC-Behandlung beobachtet. Im Gegensatz hierzu blieben ventrale sowie dorsolaterale Bereiche der Prostata von der Behandlung mit GC weitgehend unbeeinflusst. Fazit: 1\. Unter den getesteten Verfahren ist die wöchentliche Implantation subkutaner slow-release Pellets die beste Methode zur längerfristigen Induktion einer Hypercorticosteronaemie im Mausmodell. 2\. Osteoblasten sind das primäre Ziel von GC im Knochen. Im corticalen Knochen können exogenen GC in Abhängigkeit von der Lokalisation (Endo- vs. Pericortex) sowohl katabole als auch anabole Wirkungen entfalten. 3\. In der anterioren Prostata verursachen erhöhte Konzentrationen von GC eine selektive Epitheldysplasie, der möglicherweise ein FGF-vermitteltes, parakrines Signal des Stromas zugrunde liegt.

Background: Glucocorticoid (GC) effects in bone and in the prostate are ill defined and the underlying molecular mechanisms of GC action in both tissues are not fully understood. The aim if this thesis is to (i) validate the in vivo application of GCs in a mouse model (ii) determine the effects of exogenous GCs on the skeleton as well as bone cells and (iii) characterise the GC effects on stromal and epithelial cells in the prostate. Methods: To validate the continuous administration of GC in mice the effectiveness of subcutaneous (s.c.) GC injections, GC pumps and slow-release GC pellets were compared. In order to examine the osteoblast specific effects of GC within the skeletal system, the GC-inactivating enzyme 11βHSD2 was transgenically overexpressed specifically in the osteoblast using the 2.3kb Col1A1-promoter. Employing the optimal method of GC delivery (s.c. slow-release pellets), eight week-old male transgenic (tg) and wild-type (WT) mice (n = 20–23/group) were treated with either 1.5 mg corticosterone (CS) or placebo for 4 weeks. At endpoint, bone quality of the tibia and the L3 vertebra was assessed via histomorphometry and micro-CT analysis. Prostate morphology was determined by histomorphometry and immunohistochemistry. Results: While both CS injections and pumps consistently failed to alter serum concentration of CS effectively, the weekly replacement of CS pellets induced a prolonged hypercorticosteronemia as well as continuous suppression of serum osteocalcin concentrations in mice. After 4 weeks of CS treatment WT mice revealed a loss of endocortical bone in the tibia along with an enlargement of the bone marrow cavity. In contrast, pericortical bone formation was increased resulting in an expansion of the pericortical area and maintenance of overall cortical bone mass in the tibia. In the spine GC exposure led to a significant reduction of cortical bone area and cortical thickness in WT mice, compromising bone quality at this site. In tg mice CS treatment did not affect structure and geometry of the vertebral or tibial cortex. Histological analysis of the anterior prostate showed an abnormal and highly disorganised luminal epithelium following CS treatment compared to placebo. Molecular analysis at this site revealed a CS-induced increase in the expression of fibroblastic growth factor (FGF) 10 and 2, together with prominent stromal GC receptor expression. While these CS-induced pathologies were prominent in the anterior prostate, the dorsolateral and ventral prostate remained largely unaffected. Conclusions: (i) Weekly replacement of s.c. slow-release GC pellets induces significant hypercorticosteronemia and – among the methods tested – was the most suitable technique for long-term delivery of GC in mice. (ii) Exogenous GCs at lower doses exert catabolic (endocortex) as well as anabolic (pericortex) effects in the cortical bone compartment via an osteoblast- dependent mechanism. (iii) In the anterior prostate, exposure to exogenous GCs induces significant epithelial dysplasia potentially mediated via aberrant stromal-to-epithelial FGF signalling.