The Lateral Habenula: crossroad between homeostatic systems and reward circuitries

Abstract

Homeostasis describes the fundamental biological ability of individuals to maintain stable internal conditions in a changing environment. The homeostatic system is pivotal for the survival of individuals but also for the survival of entire species. It requires complex regulatory mechanisms to appropriately react to internal and external changes. These reactions include internal adjustments as well as behavioral responses. In vertebrates, the coordination of these mechanisms is primarily managed by phylogenetically old structures in the diencephalon and the brainstem. These structures include the hypothalamus, the habenula as a part of the epithalamus, and several brainstem nuclei. While the hypothalamus is responsible for the measurement of homeostatic parameters and induces appropriate internal responses, the monoaminergic brainstem nuclei, as the origin of the reward system, seem to be involved in the regulation of behavior. The precise relation between the homeostatic system and the reward system remains mostly unknown at present. Recently, the lateral habenular complex (LHb) has come into focus, as it provides an important anatomical link between homeostatic areas and the reward processing monoaminergic brainstem nuclei. Major projections of the LHb target the dopaminergic ventral tegmental area (VTA) and the serotonergic dorsal (DR) and median raphe nuclei (MnR). Both monoaminergic neurotransmitter systems play a central role in reward processing and reward-related decision-making. Glutamatergic LHb efferents terminate on inhibitory GABAergic neurons in the VTA, and the raphe nuclei, thereby suppressing monoamine release when required by the present behavioral context. Recent studies suggest that the LHb exerts a strong tonic inhibition on monoamine release, when no reward is to be obtained. It is yet unknown whether this inhibition is the result of a continuous external activation by other brain areas, or if it is intrinsically generated within the LHb projection neurons. Hypothesizing that the tonic inhibition is intrinsically generated by an HCN channel -mediated pacemaker activity of LHb projection neurons, retrograde tracing in rats was combined with in situ hybridization of HCN1 to HCN4 mRNAs. In fact, nearly all LHb neurons targeting VTA or raphe nuclei are equipped with HCN subunit mRNAs. While HCN1 mRNA is scarce, most neurons display strong expression of HCN2 to HCN4 mRNAs. These results are supported by quantitative PCR and immunocytochemical analyses. Thus, our data suggest that the tonic inhibition of monoamine release is intrinsically generated in LHb projection neurons and that their activity may only be modulated by synaptic inputs. In the second part of the study, the regulation of LHb activity was analyzed. A major input to the LHb comes from the lateral hypothalamus (LHA), the superior regulator of the homeostatic system. This projection is thought to transmit homeostatic information to the habenula, thereby inducing changes in the activity of the reward system. These changes could finally force the individual to perform or desist from certain behaviors currently necessary to keep the body homeostatically balanced. However, less is known about the effects of the intense hypothalamic projection on the activity of lateral habenular neurons. Consequently, we analyzed the neurotransmitters and the cellular targets of the hypothalamic projection within the LHb. Therefore, anterograde tracing into the LHA was combined with subsequent double-labeling of neurotransmitters and tracer in LHA terminals with the confocal laser scanning- and electron microscope. These analyses revealed that the hypothalamic projection to the LHb is mainly glutamatergic, using vGluT2 to fill its synaptic vesicles. Other neurotransmitters, including GABA and various neuropeptides, are not involved. Thus, the projection exerts an excitatory effect on the targeted cells. These cellular targets were analyzed in a second step. Hypothesizing a direct contact of hypothalamic terminals on LHb neurons projecting to the VTA, we combined anterograde tracing from the LHA with retrograde tracing from the VTA. After visualization of both tracers, LHb sections were scanned for these potential contacts with the confocal laser scanning microscope. In fact, many LHb neurons projecting to the VTA are densely targeted by the LHA projection. The existence of synaptic contacts is evidenced by covisualization of synaptophysin at these contact sites. In summary, the first part of this study demonstrates a strong expression of HCN channels on LHb projection neurons. Thus, an intrinsically generated pacemaker activity of LHb neurons that is only modulated by synaptic input seems to be responsible for the tonic inhibition of monoamine release. In the second part of this study, the existence of a strong glutamatergic projection from the LHA that directly targets LHb neurons projecting to the reward system is demonstrated. This is the first description of a synaptic mechanism for the modulation of the tonic LHb inhibition of monoamine release. As the hypothalamus is the homeostatic center of the brain, this study also emphasizes the role of the LHb as a major link between the homeostatic system and the reward system.

Der Begriff „Homöostase“ beschreibt die grundlegende biologische Fähigkeit von Lebewesen stabile innere Bedingungen in einer sich ständig verändernden Umwelt aufrecht zu erhalten. Das homöostatische System ist unabdingbar für das Überleben einzelner Lebewesen, genauso wie für das Bestehen der gesamten Spezies. Es erfordert komplexe regulatorische Mechanismen, um adäquat auf innere und äußere Veränderungen zu reagieren. Diese Mechanismen umfassen sowohl interne Anpassungen, als auch Änderungen des Verhaltens. In Wirbeltieren werden diese Mechanismen durch phylogenetisch alte Strukturen im Zwischenhirn und Hirnstamm koordiniert. Beteiligte Strukturen sind der Hypothalamus, die Habenula als Teil des Epithalamus, sowie verschiedene Hirnstammkerne. Während der Hypothalamus für die Messung homöostatischer Parameter und die Auslösung innerer Anpassungen verantwortlich ist, scheinen die monoaminergen Hirnstammkerne, als Ursprung des Rewardsystems, Änderungen im Verhalten zu bewirken. Über das genaue Zusammenspiel zwischen homöostatischem System und Rewardsystem ist momentan wenig bekannt. In letzter Zeit ist die laterale Habenula (LHb) vermehrt in den Fokus gerückt, da sie eine wichtige anatomische Verbindungsstelle zwischen den homöostatischen Arealen und den Reward verarbeitenden Hirnstammkernen darstellt. Die Hauptprojektionen der LHb erreichen die dopaminerge ventral tegmental area (VTA) und die serotonerge dorsale- (DR) und mediane Raphe (MnR). Beide monoaminergen Neurotransmittersysteme spielen eine zentrale Rolle in der Verarbeitung von Reward sowie der Reward-basierten Entscheidungsfindung. Glutamaterge Projektionen der LHb enden dabei auf inhibitorischen GABAergen Neuronen in der VTA und den Raphe Kernen, wodurch eine Unterdrückung der Monoamin-Freisetzung in entsprechenden Situationen möglich ist. Aktuelle Studien zeigen, dass die LHb auch dann eine starke kontinuierliche Hemmung der Monoamine-Freisetzung vermittelt, wenn gerade kein Reward zu verarbeiten ist. Es ist momentan nicht bekannt, ob diese kontinuierliche Hemmung das Resultat einer andauernden externen Aktivierung der LHb durch andere Hirnregionen ist, oder ob sie intrinsisch in den Projektionsneuronen der LHb selbst erzeugt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass die kontinuierliche Hemmung intrinsisch, durch eine HCN-Kanal vermittelte Spontanaktivität der LHb Projektionsneurone, generiert wird. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde die Technik des retrograden Tracing in Ratten mit In Situ Hybridisierungen von HCN1 bis HCN4 mRNAs kombiniert. Tatsächlich exprimieren beinahe alle Projektionsneurone der LHb, die zur VTA oder den Raphe Kernen projizieren HCN mRNAs. Während HCN1 mRNA nur in wenigen Zellen nachweisbar ist, zeigen die meisten Neurone eine starke HCN2-, HCN3- und HCN4- Expression. Diese Ergebnisse werden durch quantitative PCR und immunzytochemische Analysen bestätigt. Insgesamt sprechen unsere Daten dafür, dass die kontinuierliche Hemmung der Monoamin-Freisetzung intrinsisch in LHb Projektionsneuronen generiert wird und dass ihre Aktivität lediglich durch synaptische Eingänge moduliert wird. Im zweiten Teil der Studie wurde die Regulation der LHb Aktivität untersucht. Eine Hauptafferenz der LHb kommt aus dem lateralen Hypothalamus (LHA), dem obersten Steuerungszentrum des homöostatischen Systems. Es wird angenommen, dass diese Projektion homöostatische Informationen zur Habenula übermittelt, wodurch Veränderungen in der Aktivität des Rewardsystems ausgelöst werden. Diese Veränderungen könnten das Lebewesen letztendlich zu Verhaltensweisen veranlassen, die momentan zur Aufrechterhaltung des homöostatischen Gleichgewichts nötig sind. Allerdings ist wenig über die genauen Effekte der hypothalamischen Projektion auf die Aktivität der Neurone in der LHb bekannt. Um diese Effekte zu charakterisieren, untersuchten wir die Neurotransmitter und die Zielzellen der hypothalamischen Projektion in der LHb. Dazu wurde anterogrades Tracing aus dem lateralen Hypothalamus mit anschließendem Doppelnachweis von Tracer und Neurotransmittern in hypothalamischen Terminalen in der LHb, mittels Konfokalem Laser Scanning- und Elektronen Mikroskop, kombiniert. Diese Analysen zeigten, dass die hypothalamische Projektion zur LHb hauptsächlich Glutamat als Neurotransmitter verwendet. Andere Neurotransmitter, wie GABA oder Neuropeptide scheinen keine Rolle zu spielen. Aus diesen Ergebnissen ergibt sich, dass die hypothalamische Projektion einen exzitatorischen Effekt auf ihre Zielzellen vermittelt. Diese Zielzellen wurden in einem nächsten Schritt untersucht. Wir stellten dazu die Hypothese auf, dass es direkte Kontakte der hypothalamischen Terminalen zu LHb Neuronen mit Projektion zur VTA gibt. Um dies zu belegen wurde anterogrades Tracing aus dem LHA und retrogrades Tracing aus der VTA kombiniert. Nach Visualisierung beider Tracer wurden Schnitte der LHb im Konfokalen Laser Scanning Mikroskop auf mögliche Kontaktstellen hin untersucht. In der Tat werden zahlreiche LHb Neurone mit Projektion zur VTA dicht von hypothalamischen Terminalen innerviert. Die Existenz von Synapsen wurde durch den Nachweis von Synaptophysin an den Kontaktstellen bewiesen. Zusammengefasst zeigt der erste Teil der Arbeit die starke Expression von HCN Kanälen in der Mehrzahl der LHb Neurone mit Projektionen zur VTA und den Raphe Kernen. Daher erscheint eine intrinsisch generierte Spontanaktivität dieser Neurone für die kontinuierliche Hemmung der Monoamin-Freisetzung verantwortlich zu sein. Im zweiten Teil der Untersuchung wird die Existenz einer starken glutamatergen Projektion vom Hypothalamus mit direkten Kontakten zu LHb Projektionsneuronen gezeigt. Dies ist die erste Beschreibung eines synaptischen Mechanismus für die Modulation der kontinuierlichen, LHb-vermittelten Hemmung der Monoamine-Freisetzung. Mit dem Hypothalamus als homöostatischem Zentrum des Gehirns, hebt die vorliegende Arbeit die Bedeutung der Habenula als entscheidende Verbindungsstelle zwischen homöostatischen Arealen und dem Rewardsystem hervor.