Untersuchung von Funktion, Dynamik und strukturellen Änderungen des Maltose- ABC-Transporters mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzdepolarisation

Abstract

Adenosine triphosphate (ATP)-Binding-Cassette (ABC-)Transporter sind Membranproteine, die durch ATP-Hydrolyse und den damit verbundenen Konformationsänderungen den Transport von verschiedenen Substraten gegen ihren jeweiligen Konzentrationsgradienten ermöglichen. Kanonische ABC-Importer benötigen ein Substrat-Bindeprotein, welches als Rezeptor zum Einfangen des Substrats und zur Interaktion mit den extra-cytoplasmischen Loop-Regionen der transmembranen Domäne für die Initierung des Transports benötigt wird. Trotz der hohen Anzahl an Struktur-, biochemischen und biophysikalischen Daten ist nicht eindeutig geklärt, wie die Regulation der Wechselwirkungen zwischen dem Substrat-Bindeprotein und dem Transporter durch die Verfügbarkeit von ATP und Substrat funktioniert. Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie-Zerfallsmessung in Kombination mit ortsspezifischem Fluoreszenz-Labeling wurde verwendet, um die Dynamik der periplasmatischen Oberfläche des Maltosetransporters MalFGK2 und seinem periplasmatischen Maltose-Bindeproteins MalE von Echerichia coli/Salmonella typhimurium im Pikosekunden- und Nanosekundenbereich zu erforschen. Hierzu wurde ein Labeling-Protokoll für die Fluoreszenzmarkierung von MalFGK2 und MalE optimiert und die Aktivität des gelabelten Transporters über die ATP-Hydrolysefähigkeit getestet. Dafür wurde ein Malachitgrün-Assay zur Quantifizierung des durch die ATP-Hydrolyse freigesetzten Phosphats benutzt. Allerdings wurden hohe Variationen der Phosphatkonzentration bei Nutzung des Anwendungsprotokolls des Herstellers gemessen. Das Proktoll wurde deshalb unter Beachtung der Effekte, welche z. B. durch Glycerin, SDS und den Fluorszenzmarker verursacht werden, optimiert. Als Ergebnis konnten hoch reproduzierbare Phosphat-Konzentrationswerte unter optimalen Bedingungen für solubiliserte Membranproteine erzielt werden. Zeitaufgelöste Fluoreszenzdepolarisation wurde benutzt, um Informationen über die Dynamik und Interaktion des großen P2-Loops der transmembranen Untereinheit MalF, des P1-Loop und des P3-Loop (scoop loop) von der transmembranen Untereinheit MalG zu erhalten. Die Ergebnisse wurden dann mit den Dynamik-Veränderungen der beiden Bereiche von MalE korreliert. Dabei hat sich gezeigt, dass die Bewegung des P2-Loops im Grundzustand (resting state) von der Transmembrandomäne vollständig entkoppelt ist. Insbesondere wurde die Immobilisierung des P2-Loops in Anwesenheit von unbeladenen MalE und in Abwesenheit von ATP wie auch in der Anwesenheit von ATP und dem dem beladenen MalE beobachtet. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass MalE in der Lage ist mit dem Transporter unabhängig von ATP und Maltose zu interagieren. Darüber hinaus konnte eine differentielle Bindungsaffinität von MalE an den Transporter in Abhängigkeit von der Vefügbarkeit von Maltose über die Immobilisierung des P2-Loops detektiert werden. Bindung von ATP an den Transporter und Bindung von Maltose an MalE führt zu unterschiedlichen Konformationsänderungen in den beiden Segmenten von MalE.

Adenosine triphosphate (ATP)-Binding-Cassette (ABC) membrane transporters convert energy from ATP binding and hydrolysis into conformational changes of the transporter to allow translocation of substrates across the membrane against the concentration gradient. Canonical ABC import systems require a substrate binding protein that functions as a receptor to capture the substrate and interact with the extra-cytoplasmic loop regions of the transporter to initiate transport. Despite the large amount of structural, biochemical and biophysical data it is not clear how the dynamical interplay between receptor and transporter is regulated by the availability of ATP and substrate. Fluorescence anisotropy decay measurements in combination with site-directed fluorescence labeling was used in this work to study the dynamics of the periplasmic surface of the Echerichia coli/Salmonella typhimurium maltose transporter MalFGK2 and its periplasmic maltose binding protein MalE. A labeling protocol for MalFGK2 and MalE with fluorescein was optimized to yield fluorescently labeled proteins. The activity of the fluorescently labeled membrane transporter which together with MalE was then studied using ATP hydrolysis as an indicator. In order to quantify the liberated phosphate upon ATP hydrolysis, a commercially available malachite green assay was used. However, strong variations in phosphate concentration were measured when using the supplier’s handling protocol. The protocol was therefore optimized by taking into account the effects mediated by glycerol, SDS, and fluorescent the label on the sample. As a result, highly reproducible phosphate concentration values under conditions optimal for solubilized membrane proteins were obtained. Time-resolved fluorescence depolarization was used to study the dynamics and interaction of the large P2-loop in the transmembrane subunit MalF, as well as of the P1-loop and the P3-loop (scoop loop) in subunit MalG. The results were correlated with the dynamical changes in the two lobes of MalE. It was found that the P2-loop dynamics is fully decoupled from the transmembrane domain in the inward facing resting state of the transporter. MalE is able to interact with the transporter independent of ATP and maltose. Binding of ATP to the transporter and maltose binding to MalE induce specific and differential conformational changes in the two lobes of MalE. Strikingly, an immobilization of the P2-loop in the presence of unliganded MalE and absence of ATP, as well as in the presence of ATP and liganded MalE, was observed.