Highly pathogenic enteroviruses such as CVB3, EV D68 or EV71 have emerged as global threat for the human health with no treatment available to date. Polyprotein processing by the viral 3C protease (3Cpro) represents an essential step within the replication cycle of all enteroviruses, which spurred the development of anti-enterovirus agents by targeting the 3Cpro. Peptidomimetic analogues of the natural substrate are the most potent inhibitors developed so far. Yet, their inherent poor pharmacokinetic properties due to their peptidic nature limit clinical applicability. The primary aim of this thesis is the design of non-peptidic, covalent 3C protease inhibitors to cope with the impending threat of enterovirus infections. This was pursued through a computer-driven fragment-based approach in close collaboration with the group of Prof. Rademann. At first, the structural characteristics essential for covalent CVB3 3Cpro binding were derived from co-crystal structures and transferred into a 3D pharmacophore model, which served as basis for the subsequent fragment screening of an in-house small molecule collection. A virtual screening enriched selection of fragments was evaluated in a FRET-based enzyme kinetic assay, which led to the identification of a fragment hit with favorable 3Cpro binding characteristics. Due to its hydrolytic instability, scaffold hopping within commercial fragment space was pursued, which led the identification of additional 3Cpro binding fragments. Integration of protein mass spectrometry data into the established structural model enabled the rationalization of the fragment 3Cpro binding through a novel type of covalently binding substructure. For the fragment optimization, a rational de novo design workflow was developed, in which commercially available building blocks and synthesis oriented reaction rules are applied to grow the fragment within the active site of the 3Cpro in silico. Proposed fragment analogues were synthesized by the collaborating group according to the virtual design scheme, which led to the identification of 3Cpro inhibitors active in the micromolar range. In the second part of the thesis, the analysis of a noncompetitive 3Cpro inhibiting fragment, identified through the scaffold hopping, is described. Structure activity relationships derived from literature and through the biological evaluation of analogues were used for subsequent binding hypothesis generation. An allosteric pocket was identified through computational hot spot analysis and molecular dynamics simulations within the RNA binding site of the 3Cpro, which essential role in enterovirus genome replication provides biological relevance. A model for allosteric 3Cpro binding was developed through integration of the structure activity relationship data and statistical information of protein-ligand interaction patterns derived from molecular dynamics simulations. The reported findings provide a novel way to target the pivotal 3Cpro as our identified and rationally designed inhibitors represent a new structural basis for the development of non-peptidic anti-enteroviral drugs. In addition, the identified allosteric binding site enables a novel, complementing way to address this essential target and thus to combat enterovirus infections.
Das Auftreten hochpathogener Enteroviren wie CVB3, EV D68 oder EV 71 stellt eine globale Gefahr für die menschliche Gesundheit dar. Die Spaltung des viralen Polyproteins durch die 3C Protease ist ein essentieller Schritt im viralen Replikationszyklus aller Enteroviren, weshalb sich die Entwicklung von Wirkstoffen auf die 3C Protease konzentriert hat. Die potentesten daraus hervorgegangenen Inhibitoren der 3C Protease sind Analoga des natürlichen Substrates, deren peptidische Struktur zu pharmakokinetischen Nachteilen führt und den klinischen Nutzen einschränkt. Das Ziel dieser Arbeit besteht in dem Design neuartiger, nicht-peptidischer Inhibitoren für die 3C Protease als Grundlage für Entwicklung anti-enteroviraler Wirkstoffe. Dies wurde über einen computergestützten, fragment-basierten Ansatz in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Rademann verfolgt. Zunächst wurden die für die kovalente CVB3 3C Protease Bindung essentiellen Strukturmerkmale aus Kristallstrukturen abgeleitet und in ein 3D-Pharmakophormodell überführt, das als Grundlage für ein sich anschließendes Fragment Screening einer in-house Molekülbibliothek diente. Die biologische Testung von durch das Bindungsmodell vorselektierten Fragmenten in einem FRET-basierten enzymkinetischen Assay lieferte einen Hit mit günstigen 3C Protease Bindungseigenschaften. Auf Grund dessen hydrolytischer Instabilität wurde eine Suche nach Strukturanaloga in Bibliotheken von kommerziell erhältlichen Fragmenten durchgeführt, die zur Identifizierung weiterer 3C Protease bindender Fragmente führte. Mit Hilfe massenspektrometrischer Daten konnte die Protein-Fragment Bindung über eine neuartige kovalent-bindende Substruktur aufgeklärt und eine rationale Bindungshypothese erstellt werden. Für die Optimierung der Fragmente wurde ein de novo-Design basierter Workflowentwickelt, in dem Moleküle in der aktiven Tasche der 3C Protease virtuell durch das Anknüpfen chemischer Bausteine optimiert werden. Vorgeschlagene Verbindungen wurden in der Kooperationsgruppe dem virtuellen Schema folgend synthetisiert und führten zur Identifizierung micro molarer 3C Protease Inhibitoren. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Analyse eines nicht-kompetitiv bindenden Fragments beschrieben, welches ebenfalls im Rahmen der Suche nach Strukturanaloga identifiziert wurde. Strukturaktivitätsbeziehungen wurden durch die biologische Testung weiterer Analoga gewonnen oder der Literatur entnommen und für die anschließende Generierung von Bindungshypothesen verwendet. Eine allosterische Bindungsstelle wurde durch computer-basierte Hotspot Analysen und Molekulardynamik-Simulationen innerhalb der RNA-Bindungsdomäne der 3C Protease identifiziert, die aufgrund ihrer essentiellen Rolle für die Enterovirus Genomreplikation biologische Relevanz aufweist. Die Integration der erhaltenen Strukturaktivitätsbeziehungen und von Molekulardynamik-Simulationen abgeleiteten Protein-Ligand Interaktionsmustern ermöglichte die Generierung eines dynamischen Modells für die allosterische Bindung von Inhibitoren an die 3C Protease. Die im Rahmen dieser Arbeit identifizierten und rational entworfenen Inhibitoren ermöglichen einen neuen Ansatz zur Hemmung der 3C Protease für die Entwicklung nicht-peptidischer Wirkstoffe zur Therapie von Enterovirus Infektionen. Darüber hinaus ermöglicht die identifizierte allosterische Bindungsstelle eine ergänzende Möglichkeit, die Aktivität der 3C Protease zu modulieren.
