To date, mutations in ~75 different genes have been associated with mental retardation (MR), but these likely only represent the tip of the proverbial iceberg. A diminished ability to adapt to the daily demands of a normal social environment, an onset during childhood and an intelligence quotient < 70 define MR. Anatomical post-mortem examinations have demonstrated that dendritic spines, which are responsible for synaptic connections in the brain, are abnormal in different forms of MR. A large body of evidence shows that learning changes spine morphology and synaptic plasticity through remodelling of the Actin cytoskeleton. Mutations upsetting such remodelling cause MR. In uniting a pathologic phenotype with a specific genotype, disease-associated balanced chromosomal rearrangements provide a unique opportunity to identify genetic loci relevant to health. In this study, we characterised two novel genes that are disrupted by a de novo apparently balanced t(X;8) translocation in a mildly mentally retarded patient. While the autosomal breakpoint disrupts hFBXO25, the X-chromosomal breakpoint interrupts hKIAA1202. After characterising the genomic structure of hFBXO25 and its murine counterpart, establishing their expression patterns and investigating their subcellular localisation, we discovered that hFBXO25 is a bona fide F-box protein (FBP), which forms part of the SCFhFBXO25 complex. FBPs confer substrate specificity to the SCF E3 ubiquitin ligases, which poly-ubiquitinylate cell cycle regulators for proteasomal degradation. In line with their function, misregulation of and mutations in FBPs have been mostly associated with malignancies; a direct link between FBPs and MR has not yet been reported. Based on the genomic structure of hKIAA1202, and after having confirmed its expression in both foetal and adult human brain, we and several collaborators performed an extensive mutation analysis. This effort resulted in the identification of a second patient with mild MR carrying a different de novo apparently balanced translocation also disrupting hKIAA1202, a silent substitution possibly affecting an exonic splice enhancer in a small family with MR and a c.3266C>T missense exchange segregating with severe MR characteristic of the Stocco dos Santos syndrome. As hKIAA1202 is subject to X chromosome inactivation (XCI) and both translocation carriers show skewed XCI leading to inactivation of the intact X chromosome, their genetic make-up is predicted to represent a hKIAA1202 null mutation. However, RT-PCR experiments and generation of an a-hKIAA1202 antibody demonstrated that uncharacterised hKIAA1202 isoforms, which the c.3266C>T transition could affect, are still present in a cell line of the t(X;8) patient. Owing to secondary selection processes, certain mutations result in skewed XCI. Such mutations are often lethal to hemizygous male offspring, resulting in increased frequencies of spontaneous abortion in carrier females. Therefore, the Stocco dos Santos hKIAA1202 variant could explain the skewed XCI observed in all carrier women and may be the cause of the large number of spontaneous abortions and high rate of infant mortality in the family. Based on its domain structure, which is compatible with molecular scaffolding and binding of filamentous Actin (F-actin), we have established hKIAA1202 as one of the founding members of the Shroom family of cytoskeleton-associated proteins. By anchoring over-expressed hKIAA1202 to the mitochondria, we demonstrated that it can direct the subcellular distribution of F-actin in vivo. We also demonstrated co- localisation of endogenous hKIAA1202 with F-actin at sites of rapid Actin remodelling, such as the leading edge of fibroblasts and the neurites of differentiating neuronal cells. Preliminary in vitro studies indicate an interaction between hKIAA1202 and F-actin. Employing yeast two-hybrid methodology, we identified Vimentin, a cytoskeletal intermediate filament, and several proteins involved in chromatin remodelling and transcriptional regulation as putative hKIAA1202 interaction partners. Interference with transcriptional regulation, mainly through chromatin remodelling, has been established as a mechanism underlying the aetiology of MR. Taken together, we have provided evidence suggesting hKIAA1202 as a gene involved in human cognition. Such a role is unlikely for hFBXO25.
Bis heute wurden Mutationen in ~75 unterschiedlichen Genen mit dem Krankheitsbild der geistigen Behinderung (GB) assoziiert. Es ist jedoch anzunehmen, dass weit mehr dieser Loci existieren. GB wird als eine verringerte Anpassungsfähigkeit an die Anforderungen definiert, die eine normale soziale Umgebung mit sich bringt, die in der Kindheit beginnt und mit einem Intelligenzquotienten von < 70 einhergeht. Durch Autopsien an GB- Patienten konnte gezeigt werden, dass dendritische Dornen (engl. spines), welche an der Bildung synaptischer Verbindungen im Gehirn verantwortlich sind, morphologische Veränderungen aufweisen. Es wird angenommen, dass das Lernen zu einem Umbau des Aktin-Zytoskeletts führt und somit die Morphologie der dendritischen Dornen und die synaptische Plastizität verändert. Mutationen, die eine Beeinträchtigung dieses Umbaus verursachen, können eine GB hervorrufen. Die Untersuchung von krankheitsassoziierten balancierten Chromosomenaberrationen stellt eine Möglichkeit dar, Phänotyp und Genotyp zu verknüpfen um neue, krankheitsrelevante Gene zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden zwei neue Gene untersucht, die durch eine de novo balancierte t(X;8) Translokation in einer leicht geistig behinderten Patientin unterbrochen sind. Während der autosomale Bruchpunkt (BP) das hFBXO25 Gen unterbricht, trennt der X-chromosomale BP das hKIAA1202 Gen. Nach der Charakterisierung der genomischen Struktur des menschlichen hFBXO25 Gens und des homologen Gens der Maus, der Etablierung ihrer Expressionsmuster und der subzellulären Lokalisation konnte gezeigt werden, dass hFBXO25 ein F-box Protein (FBP) und Bestandteil des SCFhFBXO25 Komplexes ist. FBPe sind für die Substratspezifizität von SCF E3 Ubiquitinligasen verantwortlich, welche Regulatoren des Zellzyklus für den Abbau durch das Proteasom polyubiquitinylieren. Eine Fehlregulierung von FBPen und Mutationen in den entsprechenden Genen wurde bisher hauptsächlich mit Krebs assoziiert. Eine direkte Verbindung zwischen FBPen und GB wurde noch nicht beschrieben. Basierend auf der genomischen hKIAA1202 Struktur und nach Überprüfung seiner Expression in fötalem und adultem Gehirn, wurde in diesem Gen eine umfangreiche Mutationssuche durchgeführt. In einer kleinen Familie mit GB konnte ein stiller Basenaustausch nachgewiesen werden, welcher möglicherweise ein Spleiß-Enhancer Signal beeinträchtigt. In einer Familie mit Stocco dos Santos Syndrom wurde eine c.3266C>T Transition, die mit schwerer GB kosegregiert, nachgewiesen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass in einer leicht geistig behinderten Patientin mit einer de novo balancierten t(X;19) Translokation, das hKIAA1202 Gen unterbrochen wurde. Da das hKIAA1202 Gen der X-Inaktivierung (XI) unterliegt und beide Translokationsträgerinnen eine schiefe (engl. skewed) XI zeigen, wobei das intakte X Chromosom inaktiviert wurde, ist anzunehmen, dass ihre genetische Konstellation einen Verlust des hKIAA1202 Proteins widerspiegelt. Allerdings konnte die Expression von zuvor noch nicht bekannten hKIAA1202 RNA-Isoformen, die ebenfalls die c.3266C>T Transition aufweisen könnten, in einer Zellinie der t(X;8) Patientin durch RT- PCR Experimente nachgewiesen werden. Bei manchen Mutationen kommt es aufgrund von somatischer Selektion zu einer schiefen XI. In hemizygoten Nachkommen sind solche Mutationen häufig letal, wodurch bei Überträgerinnen in höherem Maße spontane Fehlgeburten vorkommen. Die Stocco dos Santos hKIAA1202 Variante kann demnach der Grund für die schiefe XI bei Überträgerinnen sein und für die häufigen Fehlgeburten und die hohe Säuglingssterblichkeit in der Familie eine Erklärung bieten. Basierend auf der Domänenstruktur des hKIAA1202 Proteins, die mit einer Funktion als molekulares Gerüst und mit der Bindung von Aktin kompatibel ist, wird hKIAA1202 als eines der Gründungsmitglieder der sogenannten Shroom Familie von zytoskelettassoziierten Proteinen etabliert. hKIAA1202 kann in vivo die subzelluläre Lokalisation von F-Aktin ändern, wenn es an die Mitochondrien verankert wird. Es konnte gezeigt werden, dass endogenes hKIAA1202 an Stellen schnellen Aktinumbaus, wie Führungslamellen in Fibroblasten und Neuriten von differenzierenden neuronalen Zellinien, mit F-Aktin kolokalisiert. Vorläufige in vitro Experimente weisen auf eine Interaktion zwischen hKIAA1202 und F-Aktin hin. Mittels des Hefe- Zweihybridsystems konnten mögliche hKIAA1202 Bindungspartner identifiziert werden. Dazu gehören Vimentin, ein intermediäres Filament, das eine Komponente des Zytoskeletts darstellt, sowie mehrere Proteine, die eine Rolle in der Kontrolle des Chromatinumbaus und der Transkription spielen. Eine Beeinträchtigung der Transkriptionsregulation, hauptsächlich durch Chromatinreorganisation, ist ein Mechanismus der zu GB führen kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass hKIAA1202 beim Menschen wahrscheinlich an der Ausbildung kognitiver Fähigkeiten beteiligt ist. Für hFBXO25 dagegen ist dies eher unwahrscheinlich.
