Die Untersuchung des antiapoptotischen Effekts von TAT-p21 bei der Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie in der Maus

Abstract

Kardiomyozyten sind weitgehend enddifferenzierte, postmitotische Zellen. Deswegen ist das adulte Myokard nicht in der Lage den Verlust von Herzmuskelzellen durch Proliferation zu kompensieren. Die Kardiomyozytenapotose wird bei der Entwicklung der Herzinsuffizienz verschiedener Genese beobachtet. Interessanterweise besteht eine enge Verbindung zwischen den Regulationsmechanismen der Apoptose und dem Zellzyklus. Cycline/Cyclin-abhängige-Kinasen Komplexe sind erforderlich für die Ausführung des Zellzyklus und spielen gleichzeitig eine wichtige Rolle in der Regulierung der Apoptose. Cyklin/CDK-Komplexe werden durch die CDK- Inhibitoren: CIP/KIP-Proteine (u.a. p21, p27) beeinflusst. Eine Überexpression von p21 kann die Kardiomyozytenapoptose in vitro inhibieren. Der p21-vermittelte antiapoptotische Mechanismus ist sehr vielseitig und weiterhin nicht vollständig geklärt. Die Transduktion von TAT-Proteinen liefert eine neue Möglichkeit für die therapeutische Modifikation auf der molekularen Ebene. Die chemische Kopplung des TAT-Proteins an heterologes Protein ermöglicht einen direkten Transport vom Fusionsprotein in die Zellen. Zur Beurteilung der kardiotoxischen Wirkung von Doxorubicin und Testung der antiapototischen Wirkung von p21 in vivo wurden TAT-p21 und eine trunkierte, nicht-funktionelle Mutante TAT-p21ΔC verwendet. Es wurden insgesamt 5 Versuchsgruppen gebildet. Dabei wurde die Kontrollgruppe mit physiologischer Kochsalzlösung (NaCl/NaCl-Gruppe) behandelt, eine Gruppe mit einem gewichtsadaptierten Volumen der Kochsalzlösung und Doxorubicin (NaCl/Dox- Gruppe), eine Gruppe mit Doxorubicin und TAT-p21 (TAT-p21/Dox-Gruppe) und eine weitere mit einer nicht-funktionellen Mutante: TAT-p21ΔC und Doxorubicin (TAT- p21ΔC/Dox- Gruppe). Um den Einfluss von TAT-p21 auf unbehandelte Tiere zu untersuchen, wurde eine Gruppe von Tieren mit TAT-p21 und mit Kochsalzlösung anstatt Doxorubicin behandelt (TAT-p21/NaCl-Gruppe). Die TUNEL-Analyse zeigte einen 5-fachen Anstieg von apoptotischen Kardiomyozyten in der Gruppe der mit Doxorubicin behandelten Mäuse (20 mg/kg KG) im Vergleich zur Kontrollgruppe (Dox/NaCl-Gruppe vs. NaCl/NaCl-Gruppe: 41,75 ±4,75 vs. 8,33 ±0,88; p<0,0001). Desweiteren induzierte das Doxorubicin einen signifikanten Anstieg der Caspasen-3 /-7-Aktivität (914,95 ±42,02 RLU in der NaCl/Dox-Gruppe vs. 375,50 ±95,07 RLU in der NaCl/NaCl-Gruppe; p<0,0001). Eine simultane Applikation von TAT-p21 reduziert signifikant die Doxorubicin-induzierte Apoptose (TAT-p21 /Dox-Gruppe vs. NaCl/Dox-Gruppe: 14,46 ±2,90/105 vs. 41,75 ±4,75/105; p<0,00001). TAT-p21ΔC reduziert ebenfalls die Apoptoserate (TAT-p21ΔC/Dox vs. NaCl/Dox – 31,03 ±3,0 vs. 41,75 ±4,75 per 105, p<0,005), jedoch deutlich weniger stark (TAT-p21ΔC/Dox vs. TAT-p21/Dox: 31,03 ±3,0/105 vs. 14,46 ±2,90/105; p<0,0001). Hinsichtlich des Einflusses auf die Caspasen-Aktivität zeigen dagegen die beide Fusionsproteine eine ähnlich inhibierende Wirkung (TAT-p21/Dox-Gruppe, TAT-p21ΔC/Dox: 554,43 ±103,84 RLU, 524,02 ±119,87(RLU) vs. 914,95 ±42,02 RLU in der NaCl/Dox-Gruppe; p<0,001). Die Doxorubicin-Gabe führte zu einem signifikanten, ca. 15 %-igem Gewichtsverlust und ca. 30 %-igem Herzgewichtsverlust in allen behandelten Gruppen. Echokardiographisch wurde die Entwicklung einer dilatativen Kardiomyopathie nicht beobachtet. Der linksventrikuläre enddiastolischer Diameter (LVDd) zeigte sich in den Doxorubicin-behandelten Gruppen deutlich reduziert (4,074 ±0,38mm in der NaCl /NaCl-Gruppe vs. 3,614 ±0,16mm in der Dox/NaCl-Gruppe; 3,342 ±0,41mm in der TAT-p21/Dox-Gruppe und 3,190 ±0,25 mm in der TAT-p21ΔC/Dox-Gruppe). Die vorliegende Arbeit bestätigt den Zusammenhang zwischen Kontrollmechanismen des Zellzyklus und der Apoptose. Der Einsatz von TAT-p21 führt nicht nur durch CDK-Inhibition sondern auch durch die Interaktion mit Caspasen zur Inhibition der Kardiomyozyzenapoptose. Da die echokardiographischen Daten keinen Anhalt für eine Entwicklung einer Kardiomyopathie unter Doxorubicin-Gabe erbrachten, konnte die zentrale Rolle der Apoptose in der Pathogenese der Doxorubicin- induzierten Kardiomyopathie nicht bestätigt werden.

Cardiomyocytes are terminally differentiated postmitotic cells. Therefore, the adult myocardium is not able to compensate the loss of cardiomyocytes by proliferation. Cardiomyocyte apoptosis is observed in the development of heart failure of various origins. Interestingly, there is a close connection between the regulatory mechanisms of apoptosis and the cell cycle. Cyclin/cyclin- dependent kinase (cdk) complexes required for cell cycle progression are essential for apoptosis as well. Their activity can be inhibited by the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 (CkI). Overexpression of CkI can inhibit apoptosis induced by various stimuli in cardiomyocytes in vitro. The p21-mediated apoptotic mechanism is very complex an still not fully understood. Protein transduction process opens novel possibilities of therapeutic interference of the molecular mechanisms of heart failure. A covalent bond between protein and protein transduction domain (PTD), such as TAT peptide confers the ability to cross biological membranes. To assess the cardiotoxic effects of doxorubicin and testing of anti-apototic effect of p21 in vivo, were used TAT-p21 and a mutant lacking the cdk inhibitory activity, TAT-p21ΔC. 5 groups were formed for experiments: a saline control group (NaCl /NaCl-group), one group receiving a weight-adjusted volume of saline and doxorubicin (NaCl/Dox- group), a group treated with doxorubicin and TAT-p21 (TAT-p21/Dox-group) and another group receiving a nonfunctional mutant, TAT- p21ΔC and doxorubicin (TAT-p21ΔC/Dox-group). To investigate the effect of TAT-p21 in untreated animals, one group of animals was treated with TAT-p21 and saline instead of doxorubicin (TAT-p21/NaCl-group). TTUNEL assessment indicated a striking increase in the number of apoptotic cells in Dox-treated (20 mg/kg KG) mice compared to control group (Dox/NaCl-group vs. NaCl/NaCl- group 41,75 ± 4,75 cardiomyocytes per 105 nuclei vs. 8,33 ±0,88/105; p<0,0001). Furthermore, the doxorubicin induced a significant increase in caspase 3/7 activity (914,95 ±42,02 RLU in the NaCl/Dox-group vs. 375,50 ±95,07 RLU in the NaCl/NaCl-group; p<0,0001). A simultaneous injection of TAT-p21 significantly reduced the doxorubicin-induced apoptosis of cardiomycytes (TAT-p21/Dox-group vs. NaCl/Dox-group (14,46 ±2,90/105 vs. 41,75 ±4,75/105; p<0,00001). TAT-p21ΔC also reduces the rate of apoptosis (TAT- p21ΔC/Dox vs. NaCl/Dox – 31,03 ±3,00/105 vs. 41,75 ±4,75/105; p<0,005) but significantly less (TAT-p21ΔC/Dox vs. TAT-p21/Dox: 31,03 ±3,00/105 vs. 14,46 ±2.90/105; p<0,0001). In contrast both TAT-fusion proteins show similar inhibitory effect on caspase activity. (TAT-p21/Dox-Gruppe, TAT-p21ΔC/Dox: 554,43 ±103,84 RLU, 524,02 ±119,87(RLU) vs. 914,95 ±42,02 RLU in der NaCl/Dox- Gruppe; p<0.001). The present study confirms the relationship between control of cell cycle and apoptosis. These data suggest that TAT-p21 can protect cardiomyocytes from doxorubicin induced apoptosis in vivo. The effect observed is not only associated with the cdk inhibitory activity of p21 but also by interaction with caspase-3. Echocardiographic assessment provided no evidence of development of dilated cardiomyopathy after treatment with doxorubicin, thus the central role of apoptosis in the pathogenesis of doxorubicin-induced cardiomyopathy could not be confirmed.