Die Rolle der Activin Receptor-Like Kinase 1 (ALK1) in der Angiogenese

Abstract

Die activin receptor-like kinase 1 (ALK1) gehört zu den Typ I Ser/Thr Kinase Rezeptoren aus der Transforming Growth Factor-ß (TGF‑b) Rezeptorfamilie. ALK1 wird fast ausschließlich auf den Endothelzellen (ECs) der Blutgefäße exprimiert, und die Expression ist im Verlauf der Embryonalentwicklung und in pathogenen Situationen wie Wundheilung und Tumorangiogenese erhöht. Mutationen des ALK1-Gens bewirken erhebliche Störungen der Angiogenese; so ist in Mäusen der homozygote Knock-out embryonal lethal, und beim Menschen führen heterozygote Mutationen im ALK1-Gen zu der Gefäßerkrankung Hereditary hemorrhagic telangiectasia Typ 2 . Diese Fehlbildungen des Blutgefäßsystems deuten darauf hin, dass ALK1 eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung von Kapillaren, der Stabilisierung von Blutgefäßen und der Rekrutierung von vaskulären glatten Muskelzellen spielt. Jedoch sind die Erkenntnisse über die zellulären Funktionen von ALK1 widersprüchlich, manche Gruppen zeigen, dass ALK1 die Aktivierungsphase der Angiogenese steuert, während andere zeigen, dass die Aktivierung von ALK1 zur Maturation von neu entstandenen Gefäßen führt. Auch ist weder der Ligand von ALK1 noch der interagierende Typ II Rezeptor eindeutig bestimmt, und über die Zielgene des ALK1-Signalwegs herrscht in der Literatur ebenfalls Uneinigkeit. Daher wurden in der vorliegenden Dissertation potentielle Interaktionspartner und Liganden von ALK1 identifiziert und von ALK1 regulierte Gene untersucht. Weiterhin wurde der Einfluss der Hemmung von ALK1 auf das EC-Wachstum in vitro und auf die Tumorangiogenese in vivo analysiert, um so Rückschlüsse auf die Funktion von ALK1 ziehen zu können. Zunächst wurde die EC-spezifische Expression von ALK1 auf RNA- und Proteinebene in EC-Kulturen und auf Geweben bestätigt. Anschließend wurde in Luziferase-Reportergen-Assays die Aktivierung des Id1-Promotors durch Transfektion mit ALK1 und durch BMP-2, -6, -7 und -9 verifiziert. In weiteren Id1-Promotorstudien wurde gezeigt, dass die Kotransfektion von ALK5, Endoglin, BMPRII und ActRIIB die ALK1-induzierte Id1-Aktivierung verstärkt. Dies deutet darauf hin, dass ALK1 mit diesen Rezeptoren interagiert. Im Gegensatz dazu hemmt die Kotransfektion mit TßRII die Stimulation, was eine Kooperation mit ALK1, wie sie in der Literatur vorgeschlagen wird, unwahrscheinlich erscheinen lässt. Der Einfluss verschiedener Liganden auf die Id1-Aktivierung durch ALK1 wurde ebenfalls untersucht. GDF-15, TGF-b2 und schwächer auch Aktivin B, AB und A verstärken die Promoterstimulation und kommen daher als Liganden von ALK1 in Frage. TGF-b1 und -3 hemmen die Id1 Promotoraktivität, was gegen die in mehreren Publikationen vertretene Rolle als Liganden von ALK1 spricht. Im Luziferase- Assay zeigt sich weiterhin, dass die extrazelluläre Domäne von ALK1 (ALK1.ec) die ALK1- und Endoglin-induzierte Stimulation des Id1-Promotors blockiert, und daher als Werkzeug dienen kann, um die Hemmung der ALK1-Signaltransduktion zu untersuchen. Zur weiteren Bestätigung dieser Eigenschaft wurde mittels Western Blots nachgewiesen, dass ALK1.ec die durch ALK1 vermittelte Phosphorylierung von Smad1/5 in ECs reduziert. Mittels dieser Hemmung des ALK1-Signalweges in humanen mikrovaskulären ECs (MVECs) wurden im Array potentielle Zielgene von ALK1 bestimmt. Hierbei zeigt sich, dass ALK1 eher Gene der Aktivierungsphase der Angiogenese stimuliert, wohingegen es Gene der Maturationsphase unterdrückt. In MVEC-Proliferationsassays führt die Inhibition von ALK1 durch Zugabe von ALK1.ec zur Hemmung des durch VEGF oder bFGF stimulierten Zellwachstums. Dies bestätigt ebenfalls eine Rolle von ALK1 in der Aktivierungsphase. In vivo wurde die Rolle von ALK1 analysiert, indem die humane Melanomzelllinie A375 mit dem Konstrukt für eine sezernierte Form von ALK1.ec stabil transfiziert wurde und anschließend deren Tumorwachstum in Nacktmäusen untersucht wurde. Eine Tendenz zu geringerem Tumorwachstum zeigt sich für einige der ALK1.ec-Klone. Außerdem führte die Hemmung von ALK1 zu einer deutlich geringeren Expression von CD31-mRNA, ein Maß für die Vaskularisierung des Tumors. Somit konnte die Bedeutung einer funktionierenden ALK1-Signaltransduktion für die Tumorangiogenese gezeigt werden. Die vorliegende Dissertation weist daher auf das Potential eines ALK1-inhibierenden Wirkstoffes als Anti-Angiogenese-Krebstherapie hin, und leistet einen Beitrag zur Aufklärung der ALK1-Funktionen und der zugrunde liegenden Mechanismen der ALK1-Signaltransduktion.

Activin receptor-like kinase 1 (ALK1) is a type I ser/thr kinase receptor within the transforming growth factor (TGF‑b) receptor family. ALK1 is expressed almost exclusively on endothelial cells (ECs) of the vasculature. Its expression is upregulated during embryonic development and in pathological situations such as wound healing and tumor angiogenesis. Mutations of the ALK1 gene result in considerable angiogenic dysfunctions: mice deficient for ALK1 display embryonic lethality due to defective angiogenesis, and in humans ALK1 mutations are linked to the autosomal dominant vascular disorder hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2 . These vascular defects imply a pivotal role for ALK1 in capillar differentiation, stabilization of blood vessels, and recruitment of vascular smooth muscle cells. However, the underlying mechanisms remain poorly understood. It is discussed controversially whether ALK1 controls the activation or the maturation phase of angiogenesis. Neither the ALK1 ligand nor the cooperating type II receptor have been identified unequivocally, and several publications suggest different target genes for ALK1. In this work, potential interacting type II receptors and ligands for ALK1 were identified and genes regulated by ALK1 were analyzed. The effects of ALK1 inhibition on in vitro EC-proliferation and in vivo tumor angiogenesis were studied to draw conclusions about the function of ALK1. The EC-specific expression of ALK1 was verified through RNA and protein detection in EC cultures and on tissue sections. Furthermore, luciferase reporter gene assays served to validate the Id1 promoter activation through ALK1 or BMP-9 transfection and through addition of BMP-2, -6, or -7. Co-transfection with ALK5, endoglin, BMPRII und ActRIIB further increase the ALK1-mediated Id1 stimulation, which suggests that ALK1 interacts with those receptors. In contrast, this stimulation is repressed by TßRII, questioning the published role for TßRII as cooperating type II receptor for ALK1. When investigating the effect of potential ligands in this assay, GDF-15, TGF-b2 and to some degree also activin B, AB, and A amplified ALK1-induced activation of Id1, while TGF-b1 and -3 suppressed this activation. These results indicate that ALK1 may utilize ligands other than TGF-ß1 and -ß3, specifically GDF-15 or TGF-b2. Moreover, the luciferase reporter gene assay was used to show that incubation with the extracellular domain of ALK1 (ALK1.ec) reduced the cooperative Id1 stimulation by ALK1 and endoglin. ALK1.ec also blocked ALK1-induced Smad1/5 phosphorylation in western blots, which further proves its ability to inhibit the ALK1 pathway. Therefore, ALK1.ec served as tool to investigate the effect of ALK1 inhibition. Addition of ALK1.ec to human microvascular ECs (MVECs) was consequently used to identify potential ALK1 target genes in northern arrays. The majority of genes presumed to be upregulated by ALK1 play a role in the activation phase of angiogenesis, whereas genes associated with the maturation phase were mostly downregulated. In in vitro assays, the inhibition of ALK1 by ALK1.ec resulted in the reduction of VEGF- or bFGF-induced MVEC proliferation. These data support a function for ALK1 during the activation phase. The in vivo effect of ALK1 inhibition was studied in nude mice xenografts of the human melanoma cell line A375, which was stably transfected to sequester ALK1.ec. A tendency to reduced tumor growth was detected for ALK1.ec clones. Moreover, the expression of soluble ALK1.ec significantly decreased the expression of CD31 mRNA, an indicator of vascularization, within the tumor tissue. This reduction of vessel density shows the dependence of an efficient tumor angiogenesis on ALK1. In summary, the present work suggests ALK1 as promising drug target for interfering with tumor angiogenesis, and elucidates some of the underlying mechanisms of ALK1 signal transduction and function.