Specificity profiles of protein recognition domains in the molecular medicine

Abstract

This report describes two different research projects concerning the specificity profiles of native linear motif recognition by three modules of protein architecture, namely three WW protein interaction domains (PIDs) found in the wild-type forms of the proteins BAG3 and PQBP1, as well as in the X-linked intellectual disability (X-LID) associated Y65C point-mutation in PQBP1. The sequence diversity space on which recognition specificity was defined for WW domains corresponds to a core set of 1885 peptide probes representing the human proteomic repertoire of potential ligands. Additionally, an independent control of cross-reactive binding events was carried out and used to describe sequence elements with potential to give false-positive measurements by interaction with three different detection systems in the absence of a specific analyte. Firstly, since BAG3 is the only BAG-family member with a WW domain in its modular architecture, a specificity profile of proteomic PPXY recognition was expected to give new insights to explanations of how BAG3 diverts the fate of Hsc70-clients from co-chaperone assisted proteosomal degradation or renaturation to the co-chaperone assisted selective autophagy (CASA). CASA is known to be crucial for the homeostasis of protein factors, which sens mechanical stress. The linear motif specificity of the BAG3-WW was mapped to identify potential protein recruits for CASA and to analyze the enrichment of biological processes in the specificity profile. Finally, the role of CASA in the transduction of filamin-dependent mechano- sensing and targeting of Hsc70 clients to autophagy was identified in tension- induced adherent A7r5 smooth muscle cells, human Jurkat T lymphoblasts, and primary leukocytes. Secondly, early reports showed that the Golabi-Ito-Hall syndrome (GIHS) associated by clinical genetics to a Y65C point-mutation in the WW domain of PQBP1, the single structured domain in the modular architecture of the protein. This brought up the hypothesis that the identification of key factors with compromised recognition by the mutated WW domain could reveal important biological processes involved in the molecular medicine of X-LIDs. For this, a comparative analysis of mutant versus wild- type WW specificity profiles of PQBP1 were applied to identify probe specific mutation effects and the enrichment of biological processes in probe classes with a different stamp of the mutation effect (loss- or gain-of-function). Focus on the known PQBP1 interaction with the splicing factor WBP11, which showed a strong loss-of-function effect, suggested that the Y65C PQBP1-associated X-LID syndrome is caused by deregulation of pre-RNA splicing. This hypothesis was tested on lymphoblast cells from GIHS patients.

Diese Dissertation beschreibt zwei Forschungsprojekte, welche sich mit den Spezifitätsprofilen der molekularen Erkennung von nativen linearen Motiven durch Module der Proteinarchitektur befassen. Insbesondere handelt es sich um drei Tryptophan-Tryptophan Protein-Interaktions-Domänen (kurz: WW), die im Wildtyp der BAG3 und PQBP1 Proteine, als auch des Y65C mutierten PQBP1 vorkommen. Das mutierte Y65C PQBP1 Protein ist mit dem Auftreten des Golabi- Ito-Hall Syndroms assoziiert, einer X-verbundenen intellektuellen Behinderung (X-LID). Der Sequenzraum, in welchem die Erkennungsspezifität der WW definiert wurde, entspricht einem Satz von 1885 Peptidproben aus dem human-proteomischen Repertoire potentieller Liganden. Zusätzlich, wurde eine unabhängige Kontrolle der kreuzreaktiven Bindungsereignisse durchgeführt. Dadurch war es möglich, jene Sequenzelemente zu identifizieren, welche eine Neigung zur Wechselwirkung mit dem Detektionssystem aufweisen und somit falsch positive Ergebnisse erzeugen. CASA Projekt: Da BAG3 das einzige Mitglied der BAG ko-Chaperonen Familie mit einer WW in seiner modularen Architektur ist, wurde im ersten Projekt erwartet, dass ein Spezifitätsprofil der WW neue Einblicke liefere, um folgende Frage zu beanworten: Wie kann BAG3 das Schicksal von Hsc70-Substraten vom Abbau oder von der Renaturierung hin zur Chaperon-assistierten selektiven Autophagie (CASA) lenken? CASA ist von entscheidender Bedeutung für die Homöostase von Proteinfaktoren, die mechanischer Beanspruchung ausgesetzt sind. Die Spezifität der BAG3-WW für lineare Motive wurde durch Peptidarrays kartiert. Dadurch wurden potenzielle Proteinelementen des CASA-Komplexes identifiziert und die Anhäufung an biologischen Prozessen im Spezifitätsprofil analysiert. Schließlich wurde die Rolle von CASA in filaminabhängigen mechanosensitiven Signalwegen und im Targeting von Hsc70-Sustraten für die Autophagie in glatten Muskelzellen, humanen Jurkat T Lymphoblasten und primären Leukozyten untersucht. GIHS Projekt: Frühere Berichte belegen durch klinisch-genetische Analyse, dass das Golabi-Ito- Hall-Syndrom (GIHS) mit einer Y65C Punktmutation der WW von PQBP1 einhergeht. Die PQBP1-WW ist die einzige strukturierte Domäne, die in der modularen Architektur des Proteins vorliegt. Mit dieser Beobachtung wurde im zweiten Projekt die Hypothese aufgestellt, dass durch die Y65C-Mutation die Erkennung von Schlüsselfaktoren eingeschränkt wird. Die Identifizierung dieser Faktoren könnte zur Offenlegung von wichtigen biologischen Prozessen in der molekularen Medizin der X-LIDs führen. Um dies zu prüfen, wurden die Spezifitätsprofile beider WWs (Wildform und Y65C-Mutante) vergleichend analysiert, um somit probenspezifische Mutationseffekte zu identifizieren und als „loss-“ oder „gain-of-function“ zu klassifizieren. Eine Fokussierung auf die validierte PQBP1-Interaktion mit dem Spleißfaktor WBP11 (auch als SIPP1 bekannt), der einen starken loss-of- function Effekt zeigt, führte zur Vermutung, dass das GIHS durch die Deregulierung des pre-mRNA-Spleißens verursacht wird. Diese Hypothese wurde auf Lymphoblastenzellen von GIHS Patienten getestet.