The mechanism of peptide exchange by MHC class II molecules

Abstract

Presentation of antigenic peptides by major histocompatibility complex class II (MHC II) molecules on the cell surface is essential as it evokes different immune responses including antibody production, cell destruction, and initiation of regulatory mechanisms. Peptide loading and formation of stable MHC II/peptide complexes is catalyzed by the MHC II like protein HLA-DM (DM). A major focus of this work was to understand the molecular mechanism of DM- mediated peptide exchange which would aid in efforts to predict immunogenicity of known and emerging pathogens. Furthermore, enhanced peptide exchange of MHC II molecules by a synthetic small molecule, J10, was investigated. This small molecule has therapeutic potential as it could allow actively modifying the presented peptide repertoire which is of interest for various medicinal applications, e.g. peptide based vaccination. To address the dynamic process of peptide exchange, which involves breaking and reforming multiple peptide- MHC II interactions, various methods were applied including X-ray crystallography, NMR spectroscopy and surface plasmon resonance (SPR). SPR experiments undertaken during this doctoral work revealed definitive DM binding at increased temperature to the high-affinity MHC II/peptide complexes DR1/HA and DR2/MBP previously exhibiting no or only little DM susceptibility. This finding supports the model of a common transient MHC II/peptide conformation for high- and low-affinity MHC II/peptide complexes which is dependent on kinetic parameters and more abundant at higher temperature. Furthermore, the functional significance of the SPR data was demonstrated by correlating DM binding to a high- and a low-affinity MHC II/peptide complex with DM activity on the two complexes as measured by fluorescence polarization, showing that the two assays were in agreement. Previous studies showed that release of the peptide N-terminus is crucial for DM binding and may be facilitated by spontaneous peptide motion which is also supported by SPR and NMR data obtained during this doctoral work. However, the structural implications of a partial peptide release were unknown. In this doctoral thesis a DR1 structure is presented carrying an HA peptide variant missing the two N-terminal peptide residues (P-2, P-1) that represents an intermediate state of a MHC II molecule during peptide release. Surprisingly, no major but small conformational changes were observed including a small divergence of the DRα and DRß helices normally adjacent to the peptide N-terminus and an altered conformation of the conserved residue Valβ85 which partially opens up the P1 pocket. Overall, the DR1 structure seems to be relatively stable even if three conserved hydrogen bonds are disrupted and small conformational changes appear to destabilize the P1 anchor, which may facilitate peptide release. Peptide mobility in the MHC II peptide-binding groove was further investigated in this study by NMR experiments and revealed the presence of multiple conformations for MBP (myelin basic protein) peptide bound to DR2 molecule. These data advance the structural understanding of MHC II/peptide complexes which is so far mainly deduced from the static picture of crystal structures of MHC II/peptide complexes. The NMR approach, including biosynthetic production of isotope-labeled MBP peptide and subsequent loading onto DR2 molecules, resulted in high-quality NMR spectra and can be used to further explore details about peptide dynamics in the MHC II/peptide complex. During this work, the established NMR system was applied to investigate peptide release catalyzed by the small molecule J10 in solution. Although comparison of NMR data before and after J10 addition revealed subtle changes in peak intensities, which could indicate that the small molecule induces one of the peptide conformations, further experiments are necessary to confirm this effect. The 19F-NMR experiments performed in this study revealed a higher affinity of the small molecule to low-stability MHC II/peptide complexes than to high-stability complexes. This finding could direct co-crystallization approaches of the small molecule that aim to identify its binding site on MHC II molecules, which could in turn be important for further improvement of the function of the therapeutically interesting J10.

Präsentation antigener Peptide durch Klasse II Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) auf der Zelloberfläche ist entscheidend für den Ablauf der adaptiven Immunantwort, die Prozesse wie Antikörperproduktion, Zellzerstörung und Initiierung von Regulationsmechanismen beinhaltet. Die Peptidbeladung und Ausbildung von stabilen Peptid-MHC-Klasse-II-Komplexen wird katalysiert von HLA-DM (DM), ein untypisches MHC-Klasse-II-Molekül. Ein Schwerpunkt dieser Doktorarbeit war es, den molekularen Mechanismus des von DM katalysierten Peptidaustausches besser zu verstehen, welches Bemühungen vorantreiben könnte, die Immunogenität bekannter und neuer pathogener Organismen vorherzusagen. Desweiteren wurde der von einem kleinen Molekül beschleunigte Peptidaustausch von MHC-Klasse-II- Molekülen untersucht. Das synthetisch hergestellte kleine Molekül namens J10 hat Potential therapeutisch angewandt zu werden, da es ermöglichen könnte, aktiv das präsentierte Peptidrepertoire zu verändern, welches von Interesse ist für mannigfaltige medizinische Anwendungen, wie z.B. verbesserte Effizienz von peptidbasierten Impfstoffen. Um den dynamischen Prozess des Peptidaustausches zu untersuchen, welcher das Unterbrechen und Wiederausbilden von vielfachen Peptid-MHC-Klasse-II Interaktionen beinhaltet, wurden unterschiedliche Methoden angewandt, wie Röntgenkristallographie, NMR Spektroskopie und Oberflächenplasmonresonanz. Oberflächenplasmonresonanzexperimente in der Doktorarbeit demonstrieren, dass DM an die stabilen Peptid-MHC-Klasse-II Komplexe DR1/HA und DR2/MBP bindet, welche bis dahin keine oder nur geringe Empfindlickeit gegenüber DM gezeigt hatten. Diese Ergebnisse unterstützen das Model eines gemeinsamen Übergangszustandes für Peptid-MHC-Klasse-II Komplexe mit hoher und geringer Affinität, welcher abhängig ist von kinetischen Parametern und bei höherer Temperatur häufiger vorkommt. Desweiteren wurde in dieser Arbeit die funktionelle Bedeutung von den Oberflächenplasmonresonanzexperimenten demonstriert, indem DM Bindung und DM katalysierter Peptidaustausch von zwei Peptid-MHC-Klasse-II Komplexen mit hoher und geringer Affinität verglichen wurden. DM Aktivität wurde mit Hilfe von Fluoreszenzpolarisation gemessen und die Resultate beider Methoden zeigten gute Übereinstimmung. Vorherige Studien haben gezeigt, dass die Loslösung des Peptid-N-Terminus entscheidend ist, damit DM an MHC-Klasse-II Moleküle bindet, was wahrscheinlich durch spontane Peptidbewegung möglich ist und auch durch SPR und NMR Daten in dieser Arbeit unterstützt wird. Die Auswirkungen der partiellen Peptidloslösung auf die MHC- Klasse-II Struktur waren jedoch unbekannt. In dieser Doktorarbeit wird die Kristallstruktur eines DR1 Moleküls präsentiert, welches mit einer Variante des HA (hemagglutinin) Peptids ohne die zwei N-terminalen Aminosäuren beladen ist und somit einen Übergangszustand während der Peptidloslösung von MHC- Klasse-II Molekülen darstellt. Erstaunlicher Weise weist die Struktur keine grossen, sondern kleine konformationelle Unterschiede auf, wie z.B. ein geringes Auseinandergehen der DRα und DRß-Ketten, die sich normalerweise neben dem Peptid-N-Terminus befinden, und eine veränderte Seitenkettenkonformation von Valβ85, was zu einer teilweisen Ӧffnung der P1 Tasche führt. Im Allgemeinen scheint die DR1 Struktur relativ stabil zu sein, auch wenn drei konservierte Wasserstoffbrücken unterbrochen sind. Geringe konformationelle Veränderungen scheinen die P1 Bindungstasche zu destabilisieren, was eventuell die Peptidloslösung erleichtert. Darueberhinaus wurde in dieser Arbeit die Peptidmobilität in der Bindungstasche von Peptid-MHC-Klasse-II Komplexen mit NMR Experimenten untersucht welche die Anwesenheit mehrerer Konformationen für das MBP (myelin basic protein) Peptid im Komplex mit DR2 zeigten. Diese Daten geben ein besseres strukturelles Verständnis des Peptid-MHC-Klasse-II Komplexes, welches bisher vor allem durch das statische Bild von Kristallstrukturen beeinflusst ist. Der NMR Ansatz, welcher die biosynthetische Produktion von isotopen-markiertem MBP Peptid und anschliessender Beladung von DR2 Molekülen beinhaltet, ergab qualitativ hochwertige NMR Spektren und kann angewandt werden, um weitere Details der Peptiddynamik in der Bindungstasche zu untersuchen. Das oben beschriebene NMR System wurde während dieser Arbeit angewandt, um die von dem kleinen Molekül J10 katalysierte Loslösung des Peptids in Lösung zu untersuchen. Obwohl der Vergleich von NMR Daten vor und nach J10 Zugabe geringe Unterschiede von Signalintensitäten zeigte, welches bedeuten könnte, dass J10 eine bestimmte Peptidkonformation induziert, sind weitere Experimente erforderlich, um diesen Effekt zu bestätigen. 19F-NMR Experimente in dieser Arbeit zeigten höhere J10 Affinität zu Peptid-MHC-Klasse-II Komplexen mit geringer Affinität im Vergleich zu Komplexen mit hoher Affinität. Diese Ergebnisse können genutzt werden, um Ko-kristallisationsexperimente anzuleiten, die darauf gezielt sind, die Bindungsstelle des kleinen Moleküls zu bestimmen. Die Information der spezifischen Interaktionen zwischen J10 und MHC-Klasse-II Molekül könnte zur Verbesserung von J10 eingesetzt werden, welches Potential hat, therapeutisch eingesetzt zu werden.