Apolipoprotein E-Peptid-modifizierte Wirkstoffträgersysteme: Untersuchungen zur Aufnahme in Endothelzellen und Makrophagen

Abstract

Apolipoprotein E-abgeleitete Peptide mit alternativen Palmitoylierungspositionen Das Ziel der vorangegangenen Untersuchungen war, den Einfluss der Palmitoylierungsposition auf die Stabilität der adsorptiven Kopplung an Liposomen und deren Einfluss auf die Sekundärstruktur der Apolipoprotein E-abgeleiteten Peptide bei Interaktion mit der Lipid- Doppelschicht näher zu charakterisieren. Es zeigt sich, dass alle untersuchten dipalmitoylierten ApoE-Peptide effektiv an Liposomen binden und in der Lage sind, eine Aufnahme dieser in Hirnendothelzellen zu vermitteln. Das N-terminal an Position 1 dipalmitoylierte P2A2 1 zeigte optimale Eigenschaften für die adsorptive Kopplung an Liposomen. Es zeichnet sich durch eine stabile Bindung an POPC-Liposomen aus, die sich in einer geringen Umverteilung und einer hohen, durch Liposomenbindung induzierten Helizität zeigt. Gleichzeitig besitzt P2A2 1 eine moderate membranstörende Aktivität. Aufnahmeuntersuchungen zeigten, dass die Helizität der Peptide im Gegensatz zur Stabilität der Peptid-Liposomen-Komplexe keinen Einfluss auf die Vermittlung der zellulären Aufnahme von Liposomen hat. In der Literatur werden vorrangig kovalente Kopplungsstrategien zur Funktionalisierung von Liposomen beschrieben. Die adsorptive Bindung von Peptiden an Liposomen über sogenannte Lipidanker, nach dem Vorbild von peripheren Membranproteinen, die über Palmitoyl- oder Myristylketten an die Plasmamembran gebunden sind, stellt eine elegante Methode zur Funktionalisierung von Liposomen dar. Der Vorteil dieser Kopplungsmethode liegt vor allem in der einfachen Herstellung der Peptid- Liposomen-Komplexe. Im direkten Vergleich mit der kovalenten Funktionalisierung von Liposomen wird die chemische Modifikation der Peptide von der Bindung an die Liposomen-Komplexe (Kopplung an die Liposomen) in die vorhergehende Synthese des Peptides verlagert. Eine oft als nachteilig angeführte limitierte Stabilität der adsorptiven Komplexe gegenüber der kovalenten Bindung ist nicht gegeben. Die kovalente Kopplung eines Peptides an Liposomen stellt streng genommen nur die „adsorptive Bindung mittels eines Lipidankers“ dar. Dies entspricht der hier vorgestellten adsorptiven Kopplung durch zwei räumlich angenäherte Fettsäurereste. Internalisierungsuntersuchungen an Endothelzellen der Blutgefäße Die Untersuchung der Internalisierung verschiedener ApoE-Peptid-basierter Trägersysteme hinsichtlich ihrer Aufnahmeeffizienz und möglicher mechanistischer Differenzen erfolgte an Endothelzellen der Blutgefäße. Diese Zellen treten als erste in Kontakt mit intravenös applizierten Wirkstoffpräparationen und sind daher für eine Untersuchung der Bioverteilung von besonderem Interesse. Die Fluoreszenzeigenschaften des Carboxyfluoresceins sind stark von der Art der ApoE-Peptid-basierten Träger abhängig. Die großen Unterschiede in den Fluoreszenzeigenschaften unterbinden die Möglichkeit eines quantitativen Vergleichs der Aufnahmeeffizienz zwischen den unterschiedlichen ApoE-basierten Trägerstrukturen. Für die Aufnahmeuntersuchungen musste daher eine quantitative Charakterisierung der Internalisierung auf Vergleiche unterschiedlicher Aufnahmebedingungen jeweils einer ApoE-Peptid-basierten Trägerstruktur beschränkt werden. Zudem muss die Lokalisation der Carboxyfluorescein-markierten Peptide und der mögliche Einfluss der Umgebungsbedingungen bei der Interpretation der Ergebnisse beachtet werden. Die Ergebnisse der Aufnahmeuntersuchungen deuten auf eine komplexe Aufnahme von ApoE-Peptid-Mizellen und ApoE-Peptid-markierten Liposomen, bei der unterschiedliche stereospezifische und unspezifische Membrankomponenten eine Rolle spielen. Neben dem LDLr könnte auch LRP1 als eine stereospezifische Komponente an der Aufnahme beteiligt sein. Für beide Rezeptoren wurden bereits Interaktionen mit ApoE-Peptiden gezeigt (Dyer et al. 1995; Croy et al. 2004). Allerdings können auch die Polysaccharid-Ketten des HSPG begrenzt stereoselektive Interaktionen eingehen (Brewer et al. 2002). Die Aufnahme von kleinen Partikeln mit hoher Peptiddichte erfolgt, im Gegensatz von ApoE- Peptid-markierten Liposomen, über Clathrin und weitgehend unabhängig von zellulärem HSPG. Es konnten zudem Hinweise für eine Beteiligung des LDLr an der Internalisierung sowohl von ApoE-Peptid-Mizellen als auch von ApoE-Peptid- markierten Liposomen festgestellt werden. Aufgrund der hohen Sequenzhomologie innerhalb der Rezeptorfamilien könnten auch verschiedene Mitglieder der LDL- oder Scavenger-Rezeptorfamilie, für die Interaktionen mit LDL und modifiziertem LDL beschrieben worden sind (Adachi und Tsujimoto 2006; Pluddemann et al. 2007), an der Aufnahme der unterschiedlichen Präparationen beteiligt sein. Nach diesen Ergebnissen wird die zelluläre Aufnahme nicht nur durch die Aufnahme-vermittelnde Struktur sondern auch von der Art der Trägerstruktur beeinflusst. Dabei könnte sowohl die unterschiedliche Größe der Partikel als auch die Peptiddichte auf der Partikeloberfläche eine Rolle spielen. Inwieweit die hier festgestellte Präferenz der ApoE-Peptid-Mizellen bei der Aufnahme in Hirnendothelzellen für die Entwicklung von selektiven Trägersystemen genutzt werden kann, müssen zusätzliche Experimente mit weiteren Zelllinien zeigen. Der Vorteil einer bevorzugten Aufnahme der ApoE- Peptid-Mizellen in Hirnendothelzellen könnte durch eine rasche lysosomale Degradation im Anschluss an die Clathrin-vermittelte Endozytose aufgehoben werden (Maxfield und McGraw 2004). Anwendung Apolipoprotein E-abgeleiteter Peptide für die Diagnose von arteriosklerotischen Veränderungen Arteriosklerose und Arteriosklerose bedingte Folgeerkrankungen stellen die Haupttodesursache in der westlichen Welt dar (Naghavi et al. 2003). Daher ist die Entwicklung neuer Diagnosemethoden von großer Bedeutung. Die Magnetresonanztomographie bietet die Möglichkeit, Gewebe mit hoher Auflösung und Kontrast nicht-invasiv und ohne den Einsatz ionisierender Strahlung abzubilden und ist damit hervorragend für eine frühzeitige Diagnose geeignet. Der Einsatz spezifischer Kontrastmittel wird zudem die Charakterisierung der genauen Zusammensetzung arteriosklerotischer Plaques gestatten. Die hier vorgestellten ApoE-Peptid-markierten PEG-Lipid-Mizellen bieten eine einfache Herstellung und eine hohe Lagerbeständigkeit verbunden mit einer sehr guten Signalverstärkung von arteriosklerotischen Plaques in der MRT. Die erreichte MR-Signalverstärkung ist deutlich höher als bei Lipid-Mizellen, die mit einem Antikörper gegen den MSR-A markiert wurden (Amirbekian et al. 2007). Die Signalverstärkung im MRT wird demnach durch ein erfolgreiches Targeting der Makrophagen in den arteriosklerotischen Plaques erzielt. Gegenüber herkömmlichen unspezifischen Gd3+-basierten Kontrastmitteln (bspw. Gadovist, Magnevist) stellt die auf dem Targeting von Makrophagen basierende spezifische Kontrastverstärkung von arteriosklerotischen Veränderungen durch ApoE-Peptid- markierte PEG-Lipid-Mizellen einen entscheidenden Fortschritt dar. Da die Wahrscheinlichkeit einer Ruptur von arteriosklerotischen Plaques mit deren Makrophagengehalt assoziiert wird (Virmani et al. 2000), stellen Kontrastmittel, die spezifisch Makrophagen ansteuern, eine Möglichkeit dar, die Gefährlichkeit von arteriosklerotischen Veränderungen mittels MRT zu bestimmen. Das erfolgreiche Targeting früher arteriosklerotischer Veränderungen bietet die Möglichkeit zur Entwicklung von effektiven Therapeutika. Dabei könnten Zytostatika, wie bspw. Paclitaxel, als Wirkstoff eingesetzt werden, die bereits erfolgreich an drug-eluting-stents adsorbiert wurden und dort die Restenose verhindern (Schömig et al. 2007). Abschließend lässt sich sagen, dass ApoE-markierte PEG-Lipid-Mizellen aufgrund ihrer einfachen Herstellung, dem kostengünstigen Peptid-basierten Targeting, der hohen Lagerbeständigkeit und nicht zuletzt der effektiven Signalverstärkung von arteriosklerotischen Plaques im MRT sehr gut als Kontrastmittel geeignet sind.

Apolipoprotein E-derived peptides with alternative palmitoylation-pattern The objective of the study was to investigate the influence of the palmitoylation- pattern on the stability of the adsorptive peptide-liposome-complexes and the secondary structure of the Apo E-derived peptide upon binding to the liposomal bilayer. All dipalmitoylated Apo E-peptides bind efficiently to liposomes and mediate their internalisation into brain endothelial cells. The N-terminal at position 1 dipalmitoylated P2A2-1 is ideally suited for stable adsorptive binding to POPC-liposomes. P2A2-1 has a low redistribution-rate when bound to liposomes, a high liposome-induced helicity and a moderate membrane-disturbing activity. No influence of the peptide-helicity on the uptake into endothelial cells was observed. The uptake-efficiency correlated with the stability of the peptide-liposome-complexes. So far mostly covalent strategies are described for the functionalisation of liposomes. The adsorptive binding of peptides to liposomes using palmitoylic residues is an elegant method, that is easily applied. In comparison to covalent coupling of peptides to liposomes the chemical modification of the peptide is shifted to the peptide-synthesis. The stability of adsorptive peptide-liposome-complexes is comparable to covalent complexes, as the two spatial closely positioned palmitoylic residues are structurally similar to a covalently coupled lipid. Uptake-studies with endothelial cells of the blood-vessels Endothelial cells of the blood vessels constitute the first contact area of intravenously applied drug formulations. To assess the transmembrane transport properties of cells lining blood capillaries and large vessels, we compared the uptake of different ApoE- peptide-based carrier-systems into brain capillary endothelial cells (b.End3) and aortic endothelial cells (BAEC). The fluorescence-properties of carboxyfluorescein are influenced considerably by the carrier-system. The deviating fluorescence-intensities hamper the quantitative comparison of the uptake-efficiency between different ApoE-peptide-based carrier-systems. Therefore, the uptake-studies had to be limited to the characterisation of the uptake-mechanism of each carrier-system individually. The results indicate complex uptake-patterns for ApoE-peptide-micelles and ApoE-peptide-tagged liposomes. Stereo-specific as well as –unspecific components seem to be involved. Stereo-specific components could be the LDLr or LRP1. For both receptors interactions with ApoE-derived peptides were previously shown (Dyer et al. 1995; Croy et al. 2004). However, the polysaccharide-chains of the HSPG-network can form stereo-specific interactions to a minor degree, too (Brewer et al. 2002). The endocytotic internalisation of small ApoE-peptide- micelles with a high peptide-density on their surface is mediated by clathrin and is independent of HSPG. In contrast, liposomes tagged with ApoE-peptides are internalised by a clathrin- and caveolin-independent endocytosys. The LDLr is involved in the uptake of both, ApoE-peptide-micelles and ApoE-peptide- tagged liposomes. Considering the differing endocytotic mechanisms by which these particles are internalised, this seems to be unlikely. However, because of the high sequence-homology in the LDLr-family, different receptors might be targeted. These results show, that the uptake-mechanism is not only determined by the uptake-mediating ligand, but is also influenced by the carrier-type. Important factors are the size of the carrier as well as the peptide-density on the particle-surface. The efficient internalisation of ApoE-peptide- micelles into brain-capillary endothelial cells but low uptake into endothelial cells of large vessels may provide a basis for the development of more site-specific carrier systems. Further research needs to be done in this field. However, endosomes formed after clathrin-mediated endocytosis eventually fuse with lysosomes where degradation of the internalised material occurs (Maxfield und McGraw 2004). Hence, the advantage of site specificity is likely opposed by a rather unfavorable intracellular fate of the peptide micelles. Application of ApoE-derived peptides for the diagnosis of atherosclerosis Atherosclerosis and atherosclerosis-induced secondary disorders are the leading cause of death in the industrialized countries (Naghavi et al. 2003). Therefore, the importance of the development of accurate and sensitive diagnostic methods for this disease can not be underestimated. Due to the ability of MRI to visualize soft tissue with high resolution and contrast it is highly suitable for the non-invasive and timely diagnosis of atherosclerosis. The application of specific contrast-agents will permit the characterisation of plaque composition. ApoE-peptide-tagged PEG- lipid-micelles target macrophages in the atherosclerotic plaques. The advantages are an easy synthesis, a long shelf-life and a high contrast- enhancement of atherosclerotic plaques in MRI. The signal-enhancement is higher than that of anti-MSR-A antibody-tagged lipid-micelles (Amirbekian et al. 2007). Compared to standard Gd3+-based contrast-agents (e.g. Gadovist, Magnevist), signal-enhancement of atherosclerotic plaques in MRI by the targeting of macrophages constitutes an pronounced improvement. The stability of atherosclerotic plaques is correlated with its macrophage-density (Virmani et al. 2000) and thus the probability of plaque-rupture can be estimated by MRI. The successful targeting of early atherosclerotic plaques provides the chance for an effective therapy. The application of statines, e.g. paclitaxel, as used in drug-eluting-stents, may prevent the development of advanced plaques (Schömig et al. 2007). ApoE-peptide-tagged PEG-lipid-micelles containing Gd3+ are promising new contrast-agents that are excellently suited for the improved MRI based diagnosis of atherosclerosis.