Coiled-coil peptides as multivalent scaffold for carbohydrates: from receptor targeting to vaccine exploiting sugar-protein interactions

Abstract

Over the past decade, the employment of chemically-synthesized scaffolds for the delivery of biologically-relevant molecules has proven to be a highly advantageous strategy for medicinal purposes, primarily due to stabilization of the cargo and enhancement of site-targeted therapeutic effects. Conjugation to a scaffold has been shown to reduce ligand degradation, impart optimal geometric conformation and increase the likelihood of the active species reaching the target. A wide range of synthetic carriers, including dendrimers, nanoparticles, PNAs, LNAs and cell-penetrating peptides, has been explored; among these, peptides are of particular interest due to their diverse functional groups, folding properties, biocompatibility and low toxicity. In particuar, the structural simplicity and regularity of the α-helical coiledcoil folding motif makes it a suitable scaffold for multivalent ligand display. By changing only a few positions in a coiled-coil sequence, it is possible to influence the behaviour of the resulting helices, obtaining either short dimeric peptides or long, fiber-forming carriers. This thesis explores the coiled-coil motif as a scaffold for the multivalent display of peptide and carbohydrate ligands. We aspired to demonstrate the versatility of the coiled- coil motif in two distinct projects. The first study relied on the dimeric form, providing structural predictability for the rational presentation of carbohydrates for lectin targeting. The second study aimed to increase the efficiency of carbohydrate-antibody recognition by displaying ligands on a self-assembling, fiber-forming peptide. The first project is entitled “Tailored presentation of carbohydrate ligands on a coiled-coil scaffold for asialoglycoprotein receptor targeting”. In this work, we determined the binding of members of a coiled-coil glycopeptide library to hepatocytes and established the optimal distance and orientation of the galactose moieties for interaction with the asialoglycoprotein receptor using flow cytometry. We confirmed that binding occurs through receptor-mediated endocytosis via inhibition studies with cytochalasin D; moreover, fluorescence microscopy studies demonstrated the uptake of the carrier peptides into cells. The second project is entitled “A self-assembling peptide scaffold for the multivalent presentation of antigens”. Here, a coiled coil-based sequence was used to create tunable higher-order structures on the nanometer scale, allowing for the multivalent presentation of a mannose moiety and a peptide epitope, the presence of which did not interfere with selfassembly of the nanostructure. The multivalent display of these ligands led to tighter binding by both mannose-specific lectins and appropriate antibodies. The potential of the novel selfassembling peptide to display antigens in bioanalytical assays that demand high sensitivity was illustrated by decoration with a disaccharide glycotope from the surface of the Leishmania parasite. Anti-Leishmania antibodies present in human and canine sera bind their antigen more effectively in the case of multivalent display on the coiled-coil scaffold. In summary, the α-helical coiled-coil scaffolds investigated here were shown to effectively multivalently present carbohydrate and/or peptide ligands to their specific binding partners, in the context of either a well-defined precision tool (project 1) or self-assembled nanofibers (project 2). Project 1 demonstrated that a coiled-coil carrier decorated with selected ligands may be tailored-made for applications involving other therapeutically-relevant receptors. Project 2 established that a synthetically accessible fiber-forming coiled-coil scaffold can provide the multivalent effect required to enhance binding avidity of specific antibodies and/or receptors.

In den letzten Jahren stellt die Anwendung von synthetischen Gerüsten für den Transport biologisch relevanter Moleküle eine vorteilhafte Strategie in der Medizin dar. Dabei wird nicht nur der Wirkstoff stabilisiert sondern auch noch zusätzlich die Wirkungsweise am Zielort moduliert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Konjugation einer biologisch aktiven Spezies an ein Gerüst deren Stabilität erhöht wird, die optimale geometrische Konformation vermittelt wird und generell eine Erhöhung der Wahrscheinlichkeit auf ein Erreichen des Wirkstoffes am Wirkungsort stattfindet. Zu diesem Zweck wurden unterschiedlichste synthetische Träger untersucht wie zum Beispiel: Dendrimere, Nanopartikel, PNAs, LNAs und zellpenetrierende Peptide. In diesem Kontext stehen Peptide im besonderen Fokus der Forschung aufgrund ihrer zahlreichen funktionellen Gruppen, ihres vielfältigen Faltungsverhalten und ihrer Biokompatibilität sowie geringen Toxizität. Ein prominenter Vertreter, das α-helikale coiled-coil Faltungsmotif, ermöglicht durch seine strukturelle Einfachheit und Regelmäßigkeit die multivalente Präsentation von Liganden. Durch die Modifikation von wenigen Positionen in einem coiled-coil Motiv ist es möglich, einen Einfluss auf das Oligomerisierungsverhalten der resultierenden Helices auszuüben, wodurch entweder kurze Peptiddimere oder lange fibrillenartige Gerüste erhalten werden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Möglichkeit das coiled-coil Motif als ein Gerüst für die multivalente Präsentation von Kohlenhydraten oder Peptiden zu verwenden. Dazu ist es angedacht den Vorteil des coiled-coil Motifs in zwei unterschiedlichen Projekten zu demonstrieren. Im ersten Projekt wird die Dimer-Form genutzt, die eine strukturelle Vorhersagbarkeit besitzt um eine rationale Präsentation von Kohlenhydraten für eine Lektin-Interaktion zu ermöglichen. Die zweite Studie zielt auf eine Erhöhung der Effizienz einer Kohlenhydrat-Antikörper-Erkennung durch die Ligandenpräsentation auf einem selbstorganisierenden Fibrillen bildenden Peptid ab. Das erste Projekt heißt “Tailored presentation of carbohydrate ligands on a coiled-coil scaffold for asialoglycoprotein receptor targeting”. In diesem Teil konnte die Bindung der Mitglieder einer coiled-coil Glykopeptid-Bibliothek zu Heptazyten bestimmt werden und der optimale Abstand sowie die Orientierung der Galactose-Liganden für die Wechselwirkung mit dem Asialoglykoproteinrezeptor (ASGPR) durch Druchflusszytomerie etabliert werden. Anhand von Inhibitionsstudien mit Cytochalasin D wurde bestätigt, dass die Bindung durch die ASGPR vermittelte Endozytose abläuft. Darüber hinaus wurde die Aufnahme der Trägerpeptide in die Zelle mithilfe von fluoreszenz- mikroskopischen Studien nachgewiesen. Im zweiten Teil mit dem Namen “A self- assembling peptide scaffold for the multivalent presentation of antigens” wurde ein coiled-coil-basierende Sequenz genutzt um veränderbare höhergeordnete Strukturen im Nanometerbereich zu generieren. Diese ermöglichten die gleichzeitige Präsentation von Mannose-Liganden und einem Peptid-Epitop, wobei die Selbstorganisation der Helices durch die Modifikationen nicht beeinträchtigt wurde. Die multivalente Präsentation dieser Liganden resultierte in einer stärkeren Bindung durch einerseits Mannose-bindende Lektine und andererseits durch geeignete Antikörper. Weiterhin wurde das Potential dieses neuartigen selbstorganisierenden Peptids untersucht, die eingebauten Antigene in einem bioanalytischen Assay zu präsentieren, welcher einer hohen Empfindlichkeit bedarf. Dazu wurde das Peptid mit einem Disaccharid-Glykotop vom Leishmania Parasit versehen und mit humanen und caninen anti-Leishmania-Antikörpern enthaltenden Seren inkubiert. Die Bindung des Antigens durch die Antikörper erfolgte im Falle der multivalenten Präsentation durch das coiled-coil Gerüst weitaus effektiver. Zusammenfassend wiesen die in der vorliegenden Arbeit untersuchten α-helikalen coiled-coil Gerüste eine effiziente multivalente Präsentation von Kohlenhydraten und/ oder Peptiden für die entsprechenden spezifisch bindenden Partner auf. Dies wurde entweder durch ein gut definiertes Präzisionswerkzeug (Projekt1) oder durch Selbstorganisierenden Nanofasern (Projekt 2) erzielt. In Projekt 1 wurde dargelegt, dass coiled-coil Peptide, welche mit ausgewählten Liganden versehen sind, für die Anwendung zur Untersuchung von therapeutisch relevanten Rezeptoren maßgeschneidert synthetisiert werden können. Im Projekt 2 wurde gezeigt, dass synthetisch zugängliche Fibrillen bildende coiled-coil Gerüste einen multivalenten Effekt aufweisen, welcher für eine Verstärkung der Bindung eines spezifischen Antikörpers und/ oder Rezeptors erforderlich ist.