Ziel des tierexperimentellen Designs war es Eizellen in vivo zu gewinnen, die verschiedenen, definierten physiologischen Entwicklungsstadien von Follikelpopulationen zugeordnet werden konnten. Durch die parallele Bestimmung mehrerer Parameter der Eizellqualität an jeder einzelnen Eizelle, sollten Zusammenhänge in vivo zwischen chromosomalen und zytoplasmatischen Reifungsprozessen in den Oozyten untersucht werden. Insbesondere sollte dabei die follikuläre Herkunft als Einflussfaktor auf die Eigenschaften von Oozyten näher beschrieben werden. Die Oozytengewinnung erfolgte durch wiederholte transvaginale ultraschallgeleitete Follikelpunktionen, die in 120 Follikelpunktionssitzungen an 14 Mecklenburger Warmblutstuten während einer Zuchtsaison vorgenommen wurden. Die Eizellgewinnung erfolgte zunächst bei rossigen Stuten, denen 24 Stunden zuvor ein hCG-Präparat appliziert worden war. Die Follikelaspirate wurden getrennt nach präovulatorischen Follikeln und subordinanten Follikeln gesammelt. Nach einer Ablation aller sichtbaren Follikel, wurden die Stuten einer zweiten Follikelaspiration unterzogen, noch bevor sich in der neu herangewachsenen Follikelpopulation ein dominanter Follikel entwickelt hatte. Zur genaueren Charakterisierung der verschiedenen Follikelgruppen erfolgten stichprobenartig Analysen der Östradiol-17β- und Progesteronkonzentrationen in den Follikelflüssigkeiten. Die Kumulus-Oozyten- Komplexe (KOK) wurden nach der Gewinnung unter einem Stereomikroskop morphologisch beurteilt und mit Brillant-Cresyl-Blau (BCB) unter Kulturbedingungen zur Bestimmung der Aktivität der Glukose-6-Phosphat- Dehydrogenase (G-6-PDH) inkubiert. Anschließend wurden die denudierten Oozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff MitoTracker Orange CMTM Ros zur Bestimmung der mitochondrialen Aktivität und Aggregation vital inkubiert und nach einer Fixierung in Paraformaldehyd mit Hoechst 33258 zur Bestimmung der Chromatinkonfiguration parallel gefärbt. Die Östradiol-17β-Konzentrationen waren mit 1911,4±184,5 ng/ml in präovulatorischen Follikeln, mit 885,6±120,6 ng/ml in Follikeln der wachsenden und mit 54,4±155,9 ng/ml in Follikeln der subordinanten Follikelgruppe zwischen den Follikelgruppen signifikant unterschiedlich (p<0,05). Kompakte KOK wurden signifikant häufiger aus wachsenden Follikelgruppen (p<0,05) und Oozyten, die nur die Corona radiata aufwiesen tendenziell häufiger aus den subordinanten Follikelgruppen (p=0,06) gewonnen. Insgesamt wurde mittels der BCB-Färbung in einem Drittel der Oozyten eine hohe G-6-PDH-Aktivität festgestellt. Es wurden keine signifikanten Einflüsse der Follikelgruppen, der KOK-Morphologie, des mitochondrialen Aggregationsmusters oder der mitochondrialen Aktivität auf die Verteilung von Oozyten mit unterschiedlicher G-6-PDH-Aktivität beobachtet. Bei der Untersuchung der Chromatinkonfigurationen konnte gezeigt werden, dass wachsende Follikelpopulationen signifikant höhere Anteile Oozyten im fibrillären Diplotänstadium enthalten, während Oozyten aus subordinanten Follikelpopulationen gehäuft ein kondensiertes Diplotän aufwiesen (p<0,05). Oozyten, deren Kern sich im fibrillären Diplotänstadium befand, wiesen einen signifikant größeren Anteil Oozyten mit einer niedrigen G-6-PDH-Aktivität und Oozyten mit pyknotischen Chromatin einen signifikant größeren Anteil Oozyten mit einer hohen G-6-PDH-Aktivität auf (p<0,05). Oozyten, deren Chromatin pyknotisch war, fanden sich nur in subordinanten Follikelgruppen. In Oozyten aus wachsenden Follikelgruppen wurden signifikant höhere Werte (Fluoreszenzintensität/Oozyte) der mitochondrialen Aktivität gemessen als in Oozyten aus subordinanten Follikelgruppen (p<0,05). Oozyten, die nur eine Corona radiata aufwiesen und Oozyten der expandierten KOK zeigten ebenfalls signifikant höhere Werte der mitochondrialen Aktivität als Oozyten mit kompaktem Kumulus (p<0,05). Oozyten mit grob granulierten Mitochondrien zeigten eine signifikant höhere mitochondriale Aktivität als Oozyten mit fein granulierten Mitochondrien (p<0,0001). Insgesamt zeigten 28,1% der untersuchten Oozyten ein grobgranuliertes mitochondriales Aggregationsmuster und 71,8% ein fein granuliertes Aggregationsmuster. Ein signifikanter Einfluss der follikulären Herkunft oder der Chromatinkonfiguration der Oozyten auf ihr mitochondriales Aggregationsmuster wurde nicht beobachtet. Die Untersuchungsergebnisse zeigten deutlich, dass in subordinanten Follikelgruppen hauptsächlich atretische und in den wachsenden Follikelgruppen zum größten Teil vitale Follikel enthalten waren. Aufgrund der Ergebnisse kann angenommen werden, dass es bereits in unreifen Follikeln zu einer Entkopplung zwischen der chromosomalen und zytoplasmatischen Reifung in Oozyten kommen kann. Besonders in stark atretischen Follikeln könnte dieser Prozess bereits irreversibel fortgeschritten sein. Oozyten mit der gleichen Chromatinkonfiguration oder Kumulusmorphologie sollten daher bei unterschiedlicher follikulärer Herkunft hinsichtlich ihrer Entwicklungskompetenz in vitro nicht als gleichwertig betrachtet werden. Da die follikuläre Herkunft chromosomale und zytoplasmatische Eigenschaften von equinen Oozyten signifikant beeinflusst, kann das Wissen über die follikuläre Herkunft einer Oozyte als weiterer Parameter zur Abschätzung der Oozytenqualität dienen. Die erzielten Ergebnisse können in Zukunft dazu beitragen In-vitro-Systeme der Eizellreifung zu optimieren und die Oozytengewinnung auf eine möglichst hohe Anzahl entwicklungskompetenter Oozyten zu orientieren.
The aim of this study was to recover equine oocytes in vivo, which could be assigned to follicle populations in different physiologic developmental stages. By a parallel determination of several parameters of oocyte quality for every single oocyte, links between chromosomal and cytoplasmic maturation processes in vivo should be investigated. Especially the impact of the different follicular origins on the characteristics of oocytes should be described in detail. Oocyte recovery was done by repeated transvaginal ultrasound guided follicle aspiration in 14 Mecklenburger Warmblood mares, which underwent 120 follicle aspiration sessions during one breeding season. Follicle aspiration sessions were performed first during the heat of the mares, 24 hours after they had received hCG. The aspirates of the preovulatory follicles and the subordinate follicle populations were collected separately. After an ablation of all visible follicles of the mare, a second follicle aspiration session was done just before a dominant follicle had developed in the newly grown progressive follicle population. To characterise the follicle populations more closely random samples of follicle fluid from the different follicle populations were taken simultaneously and analysed for their oestradiol and progesterone content. Immediately after recovery the cumulus- oocytes-complexes (COCs) were divided in groups depending on their cumulus morphology under a stereomicroscope and incubated under culture conditions with brilliant cresyl blue (BCB), to evaluate the activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH) enzyme. The denuded oocytes were then incubated with the Mito Tracker Orange CMTM Ros vital stain to measure the mitochondrial activity and aggregation. Following a fixation with paraformaldehyde the oocytes were also subjected to Hoechst 33258 stain to detect the chromatin configuration. The oestradiol concentrations showed a level of 1911.7 ± 185.5 ng/ml in preovulatory follicles, 885.6 ± 120.6 ng/ml in growing and 54.4 ± 155.9 ng/ml in subordinate follicle populations indicating significant differences between the follicular fluid samples of the different follicle populations (p < 0.05). Significantly more oocytes with compact cumuli were found in the progressive follicle population (p < 0.05), whereas the subordinate follicle population tended to contain more oocytes, which were only covered by corona radiata cells (p = 0.06). By the measurement with BCB stain, altogether one third of the recovered oocytes showed a high G-6-PDH activity. No significant impacts of the follicle population of origin, the cumulus morphology, the mitochondrial aggregation patterns or the mitochondrial activity of the oocytes were observed on the distribution patterns of oocytes with different G-6-PDH activity. The evaluation of the chromatin configuration showed that follicles of growing follicle populations contained significantly higher proportions of oocytes with a fibrillar diplotene, while subordinante follicle populations had higher proportions of oocytes with a condensed diplotene (p < 0.05). While oocytes with the chromatin configuration of a fibrillar diplotene showed a significantly higher amount of oocytes with a low G-6-PDH activity, oocytes with pycnotic chromatin had a significantly higher number of oocytes with a high G-6-PDH activity (p < 0.05). Oocytes with a pycnotic chromatin were found in subordinate follicle populations only. The mitochondrial activity (fluorescence intensity/oocyte) was significantly increased in oocytes of growing follicle populations as compared to oocytes from subordinate follicle populations (p < 0.05). Higher levels of mitochondrial activity were found also in oocytes with an expanded cumulus and in oocytes with only corona radiata cells than in the oocytes with a compact cumulus (p < 0.05). The mitochondrial activity was significantly higher in oocytes which showed mitochondria in granulated aggregation pattern than in oocytes with fine mitochondrial aggregation pattern (P<0,0001). In total, 28.1% of the oocytes showed a granulated mitochondrial aggregation pattern and 71.8% a fine aggregation pattern of the mitochondria but no significant impact of the follicle population of origin or the chromatin configuration were found. The results of this study show clearly that subordinate follicle populations consisted mainly of atretic follicles while the growing follicle population consisted of a greater number of viable follicles. Based on the results it could be supposed that already in immature follicles chromosomal and cytoplasmic maturation processes of the enclosed oocytes can be teared apart. Especially in follicles with progressed atresia this deviation process could have already reached an irreversible stage. Therefore, oocytes with the same chromatin configuration or the same cumulus morphology but with a different follicular origin should not be taken as having the same developmental competence. Because of the significant impact of the follicular origin on chromosomal and cytoplasmic characteristics of equine oocytes, the knowledge about the follicular origin of an oocyte can be used as a parameter to assess the quality of an oocyte. The results can contribute to optimize in vitro oocyte maturation systems and should be helpful to design oocyte-recovery treatments in vivo, which results in highest numbers of developmental competent oocytes.