Recombinant expression and characterization of a prokaryotic lipoxygenase from Pseudomonas aeruginosa. Investigations into the biological role of this enzyme

Abstract

SUMMARY LOXs are lipid-peroxidizing enzymes, the biological functions of which have extensively been studied in mammals, plants and lower eukaryotic organisms. The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA), which causes life-threatening infections in immunocompromised individuals, is among the rare bacterial species, which expresses a secretory lipoxygenase (PA-LOX). Although the enzyme was already discovered in the mid-1960s, its biological relevance has not been explored. The aim of this dissertation was to characterize PA-LOX with respect to its structural and functional properties and to obtain experimental evidence for its biological role. To reach these goals PA-LOX was overexpressed as recombinant His6-tag fusion protein in E. coli and purified to electrophoretic homogeneity by a combination of different chromatographic techniques. A molecular weight of 70 kDA was determined and each enzyme molecule contained 1 iron ion. PA-LOX functions as n-6 fatty acid dioxygenase and exhibits a similar catalytic efficiency with both, arachidonic acid and linoleic acid. The enzyme was crystallized and its 3D-structure (1.48 Å) indicated that the polypeptide chain folds into a single domain. The active site, which contains the non- heme iron, constitutes a bifurcated hydrophobic cavity, which involves a phospholipid molecule as endogenous lipid ligand. Multiple mutagenesis studies indicated that the reaction specificity of PA-LOX does not follow some classical concepts worked out for mammalian LOXs. However, Ala420Gly exchange altered the reaction specificity of the enzyme and the crystal structure of the mutant enzyme (1.8 Å) suggested an altered path of intra-enzyme oxygen diffusion as mechanistic basis for the observed functional changes. In contrast to most mammalian LOX-isoforms, PA- LOX was capable of oxidizing phospholipids to specific oxygenation products even if they were incorporated in biomembranes. Long term (24 h) in vitro incubations of PA-LOX with intact erythrocytes caused hemolysis and lipidomic analysis indicated that more than 50 % of the polyenoic fatty acids present in the membrane lipids were oxygenated. It might be speculated that the catalytic activity of the secreted enzyme on the membrane phospholipids of host cells may destabilize the membrane structure allowing the pathogen to enter the cell more easily. In this case the development of PA-LOX specific inhibitors might constitute a novel concept for anti-PA therapy. Moreover, PA-LOX is capable of converting polyenoic fatty acids to anti-inflammatory and pro-resolving lipoxins. If this catalytic activity is of in vivo relevance, the pathogen can down-regulate the immune system of the host, which might be considered as part of an evasion strategy of this particular pathogen.

ZUSAMMENFASSUNG Lipoxygenasen (LOX) sind lipidperoxidierende Enzyme, deren biologische Funktionen in Säugetieren, Pflanzen und niederen Eukaryoten umfassend untersucht wurden. Das Bakterium Pseudomonas aeruginosa (PA), welches lebensbedrohliche Infektionen bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem hervorruft, gehört zu den seltenen Bakterienspezies, die eine sekretorische LOX (PA-LOX) exprimieren. Obwohl das Enzym bereits in den 1960er Jahren erstmals beschrieben wurde, konnte seine biologische Bedeutung bis heute nicht aufgeklärt werden. Die Ziele der vorliegenden Dissertation bestanden darin, die PA-LOX als rekombinantes Protein zu exprimieren und es hinsichtlich seiner strukturellen und funktionellen Eigenschaften zu charakterisieren. Die rekombinante PA-LOX weist ein Molekulargewicht von 70 kDa auf und jedes Enzymmolekül enthält ein Eisenion. Das Protein fungiert als n-6- Fettsäuredioxygenase und kann Linolsäure, Arachidonsäure und andere Polyenfettsäuren mit hoher Reaktionsrate oxygenieren. Das rekombinante Protein wurde kristallisiert und seine 3D-Struktur (1,48Å) aufgeklärt. Die Polypeptidkette faltet sich zu einer einzigen Domäne, welche das katalytisch wirksame Nichthämeisen enthält. Das aktive Zentrum der PA-LOX wird von einem gabelförmigen hydrophoben Hohlraum gebildet, der ein Phospholipidmolekül als endogenen Lipidliganden enthält. Multiple Mutageneseuntersuchungen zeigten, dass die Reaktionsspezifität der PA-LOX nicht den klassischen Konzepten folgt, die für Säugetier-LOX ausgearbeitet wurden. Der Austausch von Ala420Gly veränderte die Reaktionsspezifität des Enzyms und die Kristallstruktur der Enzymmutante deutet darauf hin, dass die Diffussion von Sauerstoff innerhalb des Proteins durch die Mutation verändert wurde. Diese strukturelle Veränderung erklärt die beobachtete Modifizierung der Positionsspezifität. Im Gegensatz zu den meisten Säugetierlipoxygenasen ist die PA-LOX in der Lage, Phospholipide zu spezifischen Oxygenierungsprodukten umzuwandeln, selbst wenn diese in Biomembranen eingebaut sind. Langzeitnkubationen (24h) der rekombinanten PA-LOX mit intakten Erythrozyten führten zur Hämolyse, wobei die Lipidom-Analyse zeigte, dass mehr als 50 % der in den Membranlipiden vorliegenden Polyenfettsäuren oxygeniert waren. Da PA in der Lage ist, eukaryotische Zellen zu infizieren, könnte man spekulieren, dass die katalytische Aktivität des sezernierten Enzyms die Membranstruktur der Wirtszellen destabilisiert, wodurch das Pathogen leichter in die Zelle gelangen kann. Sollte dieser Mechansimus zutreffen, könnte die Entwicklung von PA-LOX-spezifischen Inhibitoren von großem medizinischen Interesse sein. Darüber hinaus ist PA-LOX in der Lage, Polyenfettsäuren zu entzündungshemmenden Lipoxinen umzuwandeln. Wenn diese katalytische Aktivität auch in vivo nachzuweisen wäre, kann das Bakterium das Immunsystem des Wirts herunterregulieren, was als Teil einer Evationsstrategie dieses Erregers angesehen werden kann.