Einfluss autologer pluripotenter mesenchymaler Stammzellen auf die Knochenheilung im Modell der atrophen Pseudarthrose der Ratte unter Berücksichtigung der periostalen Rekonstruktion

Abstract

Atrophe Pseudarthrosen stellen eine der schwerwiegendsten Komplikationen der Knochenbruchheilung dar. Das biologische Potential des Knochens ist so stark reduziert, dass er ohne externe Unterstützung nicht heilt. Oft ist die Auffrischung der Fragmentenden, ein Verfahrenswechsel und die Anlage einer Spongiosaplastik erforderlich. Neben den hohen volkswirtschaftlichen Kosten erleidet der Patient eine erhebliche Einschränkung seiner Lebensqualität. Zudem entsteht durch Verfahrenswechsel und Spongiosaentnahme ein zusätzliches Operations- und Entnahmerisiko (Arrington et al., 1996). In dieser Studie wurde deshalb untersucht, inwieweit lokal applizierte autologe mesenchymale Stammzellen die frühe Heilung einer Osteotomie mit reduziertem biologischem Potential beeinflussen. Weiterhin sollten Erkenntnisse über den bisher ungeklärten Verlauf der periostalen Rekonstruktion während der Knochenheilung gewonnen und dabei analysiert werden, ob die injizierten Zellen zur periostalen Rekonstruktion beitragen. Dazu wurden 32 Ratten randomisiert in zwei Gruppen eingeteilt. Nach Knochenmarksentnahme und Expansion der aus dem Knochenmark selektierten mesenchymalen Stammzellen wurde das Os femoris in Diaphysenmitte standardisiert osteotomiert und mit einem Fixateur externe stabilisiert. Zur Schaffung einer atrophen Pseudarthrose wurde das Periost 2 mm proximal und distal des Osteotomiespaltes mit einem Elektrokauter thermisch zerstört und in diesem Bereich das Knochenmark entfernt. Zwei Tage post Osteotomie wurden bei 16 Tieren 2 x 106 MSCs/100 µl Zell-Mediumsuspension perkutan in den Osteotomiespalt injiziert (MSC-Gruppe). Die anderen 16 Tiere dienten als Kontrolle. Sie erhielten die analoge Menge des Kultivierungsmediums ohne Zellen (Medium-Gruppe). Röntgenkontrollen erfolgten post OP und im wöchentlichen Abstand. Zwei Wochen nach der Osteotomie wurden die Femora entnommen und histologisch, immunhistologisch sowie histomorphometrisch untersucht. Radiologisch und histologisch stellte sich der Heilungsverlauf in beiden Gruppen verzögert dar. Das histologische Bild beider Gruppen glich sich, bei den MSC-Tieren differenzierte das Kallusgewebe im deperiostierten Bereich häufiger zu Knorpelgewebe. Histomorphometrisch waren die Knochenfläche, die mineralisierte Fläche, die Bindegewebs- und Knorpelfläche des periostalen Kallus in der MSC-Gruppe signifikant größer. Diese Unterschiede relativierten sich jedoch bei Bezug dieser Flächen auf die periostale Gesamtfläche. In allen anderen analysierten Parametern glichen sich beide Gruppen. Die applizierten Stammzellen trugen nicht zur Unterstützung der Knochenheilung bei, noch nahmen sie einen Einfluss auf die periostale Rekonstruktion. Das Stratum fibrosum des Periost begann sich zwei Wochen nach der Deperiostierung in beiden Gruppen dezent zu rekonstruieren. Die Cambiumschicht des Periosts war dazu nicht in der Lage. Scheinbar ist eine vollständige periostale Regeneration an die Bildung eines knöchernen Kallus gebunden. Die Applikation der Zellen zu einem späteren Zeitpunkt oder die Verwendung osteogen prädifferenzierter Zellen führt möglicherweise zu einem günstigeren Heilungsverlauf.

Atrophic nonunions represent one of the most severe complications in fracture healing. The bone´s biological capability to heal is such reduced, that it necessarily needs any external support. Often the refreshment of the ends of fragments, switching osteosynthesis and transplantation of spongiosa is necessary. Besides high economic costs the patient suffers a considerable restriction of quality of life. Futhermore an increasing operation risk and donor-site morbidity may result from switching osteosynthesis and transplantation of spongiosa (Arrington et al., 1996). Therefore in this study was investigated, how far local injected autogenic mesenchymal stem cells impact the early healing of an osteotomy with reduced biological potential. Futhermore, findings about the so far unknown course of periosteal reconstruction during bone healing should be gained by analysing the role of the injected cells in periosteal reconstruction. Therefore 32 rats were randomised into two groups. After sampling of bone marrow and selection of the bone marrow´s mesenchymal stem cells took place, a standardised osteotomy of the femur´s midshaft, which was stabilised with an external fixator was performed. In order to produce the atrophic nonunion, the periosteum was cauterized circumferentially for a distance of 2 mm on each side of the osteotomy. In this area the bone marrow was removed. Two days after the osteotomy 16 animals got a percutaneous injection of 2 x 106 MSCs/100 µl cell- medium-suspension in the osteotomy gap (msc-group). The other 16 rats served as control group. These animals obtained the equivalent volume of the expansion medium without cells (medium-group). X-rays were taken directly after operation and in weekly intervals. Two weeks after osteotomy the femora was extracted for histological, immunhistological and histomorphometrical examination of the osteotomy area. In both groups the course of healing appeared delayed as well radiologically as histologically. The histological appearances were equal in both groups. The callus tissue in the cauterised area of the msc-group differentiated more often into cartilage tissue. The histomorphometrical ananlysis shows, that the bone area, the mineralised area, the connective tissue area, and the cartilage area of periosteal callus of the msc-group were significantly greater. Relating to the total callus area these differences balanced. Both groups were equal regarding all other analysed parameters. The injected stem cells neither contributed to bone healing nor did they influence periosteal reconstruction. In both groups the fibrous layer of periosteum started to reestablish discreetly two weeks after osteotomy. The cambium layer of periosteum had not the ability to do so. Apparently the complete periosteal reconstruction is bound to the formation of an osseus callus. Possibly the application of the cells at a later date (e. q. after establish of an atrophic nonunion) or the use of osteogen pre-differentiated cells would have lead to a more benefical course of healing.