dc.contributor.author
Christel, Cerstin Manuela
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:09:31Z
dc.date.available
2004-05-04T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/658
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-4860
dc.description
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis
1\. Einleitung
2\. Literaturübersicht
3\. Material und Methoden
4\. Ergebnisse
5\. Diskussion
6\. Zusammenfassung / Summary
Literaturverzeichnis
dc.description.abstract
Ziel dieser Arbeit war es, die Transkription spezifischer Zielgene mit Hilfe
eines im Rahmen dieser Doktorarbeit neu zu entwickelnden Repressorsystems
exogen induzierbar kontrollieren zu können (transcriptional targeting). In
diesem Zusammenhang sollten neue und zuvor noch nicht funktionell im Tet-
System getestete Repressorfusionen bezüglich ihrer Repressionseffizienz
charakterisiert werden. In der hier vorliegenden Arbeit wurden deshalb sieben
verschiedene Tet-Silencermoleküle (TetR (B/E)-HDAC 1,3 und 4; TetR
(B/E)-MeCP2; TetR (B/E)-Dnmt3a; TetR (B/E)-Sin3A; TetR (B/E)-EED) generiert
und zusätzlich ein Tet-abhängiges konstitutiv aktives HPRT-Responderkonstrukt
hergestellt, welches als Reportergen Luciferase exprimierte. In einer ersten
Versuchsreihe wurde das Potential der verschiedenen Tet-Repressoren zunächst
in transienten Cotransfektionsessays evaluiert. Diese Experimente zeigten,
dass der TetR (B/E)-HDAC 4-Repressor in der Lage war, die Luciferaseaktivität
des HPRT-Responders um 50% herunterzuregulieren. Um die Effizienz des TetR
(B/E)-HDAC 4-Repressors auf einem Zielpromoter zu testen, welcher im
chromosomalen Kontext vorlag, wurde in weiteren Versuchen die HRL9-Zelllinie
verwendet, welche einen konstitutiv aktiven humanen CMV-Minimalpromoter-
Responder mit dem Reportergen Luciferase sowie einen reversen Transaktivator
(rtTA) stabil in ihr Genom integriert hat. Mittels transienter Transfektion
des TetR (B/E)-HDAC 4 in die HRL9-Zelllinie war es möglich, die Transkription
des hCMV-Zielpromoters um über 60% zu reprimieren. Nach stabiler Transfektion
der HRL9-Zelllinie mit dem TetR (B/E)-HDAC 4-Repressorkonstrukt wurden zwei
Einzelklone isoliert, deren Luciferaseaktivität sich exogen über den Induktor
Doxycyclin (DOX) im Medium sowohl negativ (durch HDAC 4-Repressorbindung) als
auch positiv (durch rtTA-Transaktivatorbindung) regulieren ließ. Die mit Klon
102 durchgeführten Tet-on/off Induktionsversuche demonstrierten, dass die
transkriptionelle Zielpromoteraktivität dieses Klons bei einem
Konzentrationswechsel von 1μg/ml Medium zu DOX-freiem Medium um den Faktor 45
herunterreguliert werden konnte (shift rtTA-Transaktivatorbindung zu TetR
(B/E)-HDAC 4-Repressorbindung am Zielpromoter). Weiterhin konnte innerhalb
eines Langzeitversuches gezeigt werden, dass das reprimierende Potential der
HDAC 4 Histondeacetylase auch nach sechswöchiger, ununterbrochener Anlagerung
des Repressors an den hCMV-Promoter nicht zu einer permanenten Repression des
Promoters führte. Dieses Resultat demonstrierte, dass die epigenetische
Wirkung der Histondeacetylase 4 vollständig modulierbar bleibt und somit als
dynamisch-reversibler molekularer "switch" funktioniert. Mit Hilfe des
spezifischen Histondeacetylasehemmers Trichostatin A (TSA) konnte gezeigt
werden, dass die beobachtete Repression auf die TetR (B/E)-HDAC 4-vermittelte
Histondeacetylaseaktivität zurückzuführen war. Des weiteren gelang es im
Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des tritransgenen stabilen HRL9-HDAC 4-Klons
102, grundlegende Einsichten über den funktionalen Zusammenhang zwischen
Zellzyklusprogression und de novo Institution der Transkriptionsrepression
bzw.-aktivation zu gewinnen. Durch die Blockade des Zellzyklus mit Hilfe von
Mimosin konnte eindeutig bewiesen werden, dass die transkriptionelle
Aktivation eines Zielpromoters (hCMV-Minimalpromoter) durch den reversen
Transaktivator rtTA in der G1-Phase stattfinden kann. In Parallelversuchen
gelang es erstmalig nachzuweisen, dass Histondeacetylase 4-vermittelte
Genrepression nicht während der G1-Phase möglich war, sondern bei Progression
durch den Zellzyklus (G1-S-G2-M-Transition) stattfinden muss. Die hier
vorgelegten Daten demonstrierten daher erstmals eindeutig einen fundamentalen
Funktionsmechanismus, nämlich wie und wann Transkriptionsrepression durch den
Zellzyklus propagiert wird.
de
dc.description.abstract
The aim of this thesis was the exogenically inducible controlling of the
transcription of specific target genes by means of a repressor system that had
to be developed (transcriptional targeting). For this, new repressor fusions,
which had not been tested functionally in the Tet system before, had to be
characterized with respect to their efficiency as repressors. In the course of
this work seven different Tet-silencer molecules were generated: TetR
(B/E)-HDAC 1,3 and 4; TetR (B/E)-MeCP2; TetR (B/E)-Dnmt3a; TetR (B/E)-Sin3A;
TetR (B/E)-EED. In addition, a Tet-dependent constitutively active HPRT
responder construct was produced that - being a reporter gene - expressed
luciferase. In a first series of experiments, the potential of the different
Tet repressors was evaluated in transient cotransfection essays. These
experiments showed that the TetR (B/E)-HDAC 4 repressor was able to reduce the
luciferase activity of the HPRT responder by 50%. To test the efficiency of
the TetR (B/E)-HDAC 4 repressor on a target promoter, which was provided in a
chromosomal context, the HRL9 cell line was employed in further experiments.
This cell line has a constitutively active humane CMV-minimal promoter-
responder with the reporter gene luciferase as well as a reverse
transactivator (rtTA) integrated in its genome in a stable way. By transient
transfection of TetR (B/E)-HDAC 4 in the HRL9 cell line it was possible to
repress transcription of the hCMV target promoter by over 60 %. After stable
transfection of the HRL9 cell line with the TetR (B/E)-HDAC 4 repressor
construct, two single clones were isolated. The luciferase activity of these
clones could be regulated exogenically by the inductor doxycycline (DOX) in
the medium; regulation was achieved negatively (by HDAC 4-repressor binding)
as well as positively (by rtTA transactivator binding). The Tet on/off
induction experiments performed with clone 102 demonstrated that the
transcriptional target promoter activity of this clone could be suppressed by
a factor of 45 (shift of rtTA transactivator binding to TetR (B/E)-HDAC 4
repressor binding at target promoter) by changing the concentration from 1
μg/ml to DOX-free medium. Furthermore, a long-time experiment proved that the
repressor potential of HDAC 4 histone deacetylase did not lead to a permanent
repression of the promoter even after six weeks of uninterrupted binding of
the repressor to the hCMV promoter. This result showed that the epigenetic
effect of histone deacetylase 4 remains fully tunable, and thus works as a
dynamical, reversible molecular switch. By means of the specific histone
deacetylase supressor trichostatine A (TSA) it could be shown that the
observed repression was due to the TetR (B/E)-HDAC 4-induced histone
deacetylase activity. In the course of this work, fundamental insight into the
functional dependence between cell cycle progression and de novo institution
of transcription repression and activation was achieved with the tritransgenic
stable HRL9-HDAC 4 clone 102. Blocking the cell cycle with mimosine was able
to prove that transcriptional activation of a target promoter (hCMV minimal
promoter) can take place in the G1 phase through the reverse transactivator
rtTA. Parallel experiments showed for the first time that histone deacetylase
4-induced gene repression was impossible during the G1 phase, but has to take
place during the progression through the cell cycle (G1-S-G2-M transition).
The data presented here show for the first time clearly a fundamental
functional mechanism, i.e. how and when transcription repression is propagated
through the cell cycle.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
transgenic animals
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Entwicklung einer innovativen Strategie zur Generierung von knock-out-
Mausmodellen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Norbert-Christian Juhr
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Franz Oesch
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Michael Schmidt
dc.date.accepted
2004-02-20
dc.date.embargoEnd
2004-05-04
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2004001079
dc.title.translated
Development of an innovative strategy for generation of knock-out mouse models
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001231
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2004/107/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001231
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access