Molekularbiologische Untersuchungen zur Pigmentsynthese von humanpathogenen Hefen

Abstract

Obwohl die Bedeutung von C. glabrata als Krankheitserreger stetig zunimmt, sind bislang nur wenige Pathogenitätsfaktoren dieses Pilzes bekannt. Die Entdeckung einer neuartigen Pigmentsynthese bei C. glabrata hat die Möglichkeit eröffnet, dass es sich analog zu den gut erforschten pilzlichen Melaninen bei diesem Pigment um einen neuen Pathogenitätsfaktor handelt könnte. In dieser Arbeit sollte deshalb der Syntheseweg des Pigments von C. glabrata analysiert und die möglichen biologischen Funktionen der Pigmentbildung bestimmt werden. Die Leitfragen waren dabei (1) wie der Syntheseweg des Pigments verläuft, (2) unter welchen Bedingungen das Pigment gebildet wird und (3) welche biologische Wirkung das Pigment für C. glabrata hat. Über Transkriptionsprofilanalysen, eine Mutantenbibliothek, die Generierung spezifischer Mutanten und die heterologe Expression des relevanten Proteins konnte die erste Frage beantwortet und der Syntheseweg identifiziert und zu einem großen Teil aufgeklärt werden. Die Pigmentsynthese ist mit dem Tryptophanabbau von C. glabrata über die Aminosäuregärung gekoppelt: die aromatische Aminotransferase Aro8, die den ersten Schritt des Abbaus katalysiert, ist auch entscheidend für die Pigmentbildung. Das entstehende Zwischenprodukt, Indolpyruvat, reagiert danach entweder über weitere Zwischenschritte zu dem Pigment oder folgt über die Phenylpyruvat- Decarboxylase Aro10 weiter dem Weg der Aminosäuregärung. Die alternative aromatische Aminotransferase Aro9 spielt bei der Pigmentierung nur eine untergeordnete Rolle. Die Bandbreite der Antworten auf die zweite Leitfrage ist breiter: Die Faktoren, die die Pigmentbildung beeinflussen, sind vielfältiger Natur. Tryptophan ist für die Synthese des Pigments unabdingbar, und Sauerstoff wird für die spontane Reaktion des Pigmentvorläufers zum eigentlichen Pigment benötigt. Alternative Stickstoffquellen, nichtfermentierbare Kohlenstoffquellen und hohe Zelldichte verringern die Pigmentbildung durch C. glabrata. Viele dieser Faktoren konnten in einem vorläufigen Modell zusammengefaßt werden, in dem an dieser Regulation der cAMP-Signaltransduktionsweg beteiligt ist, sehr wahrscheinlich über den Rezeptor Gpr1. Für das Pigment ließen sich in Beantwortung der dritten Frage auch verschiedene mögliche biologische Funktionen beschreiben. Pigmentierte Hefen sind besser gegen UV-Licht, gegen Wasserstoffperoxid und gegen die Wirkung von menschlichen Neutrophilen geschützt. Zudem zeigen sie eine deutlich höhere Schädigung von Wirtszellen in einem in vitro-Modell. In diesen Funktionen ähnelt es damit den bekannten pilzlichen Melaninen und kann somit als möglicher Pathogenitätsfaktor von C. glabrata behandelt werden. Daneben konnte aber auch gezeigt werden, dass Pigmentbestandteile die Bildung von Filamenten durch den häufig gemeinsam mit C. glabrata auftretenden pathogenen Pilz C. albicans wirksam unterdrücken können. Neben diesen direkten Antworten ergaben sich auch weitere interessante Nebenaspekte der Biologie von C. glabrata aus dieser Arbeit. So wurden hier zum ersten Mal die wichtigsten Schritte der Aminosäuregärung in C. glabrata aufgeklärt. Dabei zeigte sich, dass die beiden aromatischen Aminotransferasen von C. glabrata andere Funktionen und eine andere Regulation als in S. cerevisiae haben. Weiterhin konnte Histidin als mögliches neues Substrat von Aro8 beschrieben werden, wodurch C. glabrata im Gegensatz zu S. cerevisiae den beiden gemeinsamen Verlust der Histidase kompensiert. Auch deutete sich eine Verknüpfung des Vid- Komplexes mit der Stickstoffwahrnehmung an, wodurch eine Verbindung der Wahrnehmung von Stickstoff- und Kohlenstoffquellen möglich scheint.

The relative importance of C. glabrata as a causative agent of severe diseases is rising steadily. But in spite of this, few pathogenicity factors have been described for this fungus. Pigment synthesis by C. glabrata may constitute a novel pathogenicity factor, analogous to the well-studied fungal melanins. This work aimed to elucidate the biosynthetic pathway of pigment production and determine the biological function of C. glabrata pigmentation. Three central questions were posed: (1) how is the pigment synthesized, (2) under which conditions does pigmentation take place and (3) what is the biological role of the pigment? Using transcriptional profiling, a random mutant library, targeted knock-out mutants of C. glabrata, and recombinant expression of a central protein, the pigment biosynthetic pathway was identified and partially elucidated. Pigment synthesis is strictly coupled to tryptophan degradation in C. glabrata. The aromatic amino transferase Aro8 catalyzes both the first step in tryptophan utilization and in pigment synthesis. Indole pyruvate, the resulting intermediate, then reacts further to form the pigment. Alternatively, it follows the Ehrlich pathway of amino acid degradation via the decarboxylase Aro10, thus preventing pigment formation. The aromatic amino transferase Aro9, which acts in parallel to Aro8, plays a lesser role in pigmentation. A multitude of factors influence the pigmentation process: while tryptophan is an absolute prerequisite, other additional nitrogen sources can inhibit pigmentation. Oxygen is also required for a secondary, spontaneous reaction step after the initial intermediate formation. Non-fermentable carbon sources and high initial cell density strongly reduce the amount of pigment formed. Many of these different factors and influences can be integrated into a preliminary model of pigmentation, based on the activity of the cyclic AMP signal transduction pathway and the receptor protein Gpr1. The biological functions of this pigment are also quite diverse. Pigmented cells are better protected against the adverse effects of hydrogen peroxide, UV light and killing by human neutrophils. Furthermore, pigment containing yeasts cause more damage to human cells in an in vitro epithelial model. In these respects, the pigment resembles the well-known fungal melanins, and may thus be considered a potential pathogenicity factor of C. glabrata. In addition to these effects, pigmented supernatant of C. glabrata cultures was able to effectively repress filament production in C. albicans, a fungus known to occur in co-infections with C. glabrata. Further novel aspects of the biology of C. glabrata have been described in this work in addition to the original questions. For the first time, the initial steps of the Ehrlich pathway have been elucidated in C. glabrata. Interestingly, the function and regulation of the C. glabrata aromatic amino transferases differs from their known counterparts in the closely related baker's yeast. Furthermore, Aro8 in C. glabrata seems to accept histidine as a subtrate, in contrast to the enzyme in S. cerevisiae. This enables C. glabrata to grow on histidine as a sole nitrogen source, despite the lack of a histidase enzyme. Also, a connection between the carbon and nitrogen sensing mechanisms via the Vid complex seems plausible in light of the data presented here.