Functional analysis of the WDR66 gene

Abstract

Esophageal cancer has long been considered one of the deadliest malignancies and considerable controversy has surrounded its management. Esophageal cancer patients have a dismal prognosis, because of the late presentation of patients with this disease and the technical difficulty of an adequate surgical resection in the presence of advanced local and regional involvement. The most common histological type is esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), which is distributed throughout the length of the esophagus. In order to achieve a more tailored therapy and, consequently, improved prognosis, we studied gene expression profiles of ESCC in comparison to that of normal esophageal squamous epithelium with the aim of characterizing the changes in gene expression that underlie ESCC progression. Laser capture microdissection of frozen specimens in collaboration with an experienced pathologist was applied to collect the cells from well-defined tumor areas. Whole human gene expression profiling of ESCC specimens (n=10) and normal esophageal squamous tissue (n=18) was performed using microarray technology. Microarray results were validated by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in a second and independent cohort (n=71) consisting of ESCC (n=25), normal esophagus (n=11), esophageal adenocarcinoma (n=13), gastric adenocarcinoma (n=15) and colorectal cancers (n=7). In order to understand the functional relevance of a newly identified marker gene, siRNA-mediated knockdown was performed in a human esophageal squamous cell carcinoma cell line, KYSE520, and the effects of this treatment were checked by another microarray analysis. A gene encoding WDR66, WD repeat-containing protein 66, was found whose expression was significantly high in ESCC specimens (P < 0.0001). High WDR66 expression was significantly associated with poor overall survival (P = 0.031) of patients suffering from ESCC. Multivariate Cox regression analysis revealed that WDR66 expression remained an independent prognostic factor (P = 0.042). WDR66 knockdown by RNA interference resulted particularly in changes of the expression of membrane components. This was validated by qRT-PCR and western blotting experiments in the human squamous cell carcinoma cell line KYSE520, providing independent evidence of the changes of Vimentin (VIM) and occluding (OCLN) expression associated with the WDR66 knockdown. Gene expression level of VIM was significantly down-regulated whereas OCLN expression was significantly higher in cells treated with WDR66 siRNA by qRT-PCR (VIM, P = 0.0286; OCLN, P = 0.0186). Detection of VIM and OLCN protein by immunoblotting showed that VIM expression was significantly down-regulated while the expression of OCLN was significantly higher in KYSE520 cells treated with WDR66 siRNA. Interestingly, VIM was highly expressed (P = 0.0008) while OCLN was less expressed (P < 0.0001) in ESCC specimens in comparison to normal esophagus. This may underline a central role of WDR66 for ESCC development. Furthermore, siRNA-mediated knockdown of WDR66 resulted in suppression of cell growth, reduced cancer cell motility and enhanced cancer cell apoptosis after addition of Staurosporine and 5-Fluorouracil. According to these studies, WDR66 might be a useful biomarker for risk stratification of ESCC. As a positive modulator of epithelial-mesenchymal transition, WDR66 expression is likely to play an important role in ESCC growth and invasion. Moreover, our functional studies point toward an important role of WDR66 for squamous carcinoma cell growth and motility. In the future, WDR66 might become a novel drug target for the treatment of esophageal squamous cell carcinoma.

Karzinome der Speiseröhre werden schon lange als besonders gefährlich für den Patienten und ihre Behandlung wird weiterhin kontrovers diskutiert. Aufgrund der späten Vorstellung von Patienten mit dieser Krankheit und der technischen Schwierigkeit einer adäquaten chirurgischen Resektion bei Vorliegen von erweiterten lokalen und regionalen Rezidiven haben Patienten mit Karzinomen der Speiseröhre eine schlechte Prognose. Das häufigste Karzinom der Speiseröhre ist das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus, dessen Verteilung sich über die gesamte Länge der Speiseröhre erstreckt. Um eine maßgeschneiderte Therapie und damit verbesserte Prognose zu erreichen, suchten wir hier nach Genen mit erhöhter Expression in Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus. Dazu untersuchten wir die Genexpressionsprofile von Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus im Vergleich zu normalem Ösophagus Plattenepithel. Die Laser-Mikrodissektion von gefrorenem Probenmaterial wurde angewandt, um in Zusammenarbeit mit einem erfahrenen Pathologen (Prof. Michael Vieth, Universität Bayreuth) nur Zellen aus wohldefinierten Tumorbereichen für die Untersuchung zu selektieren. Unter Verwendung der Mikroarray-Technologie wurde ein sogenanntes „Whole human Genome Expression Profiling“ von Ösophagus- Plattenepithelkarzinomproben (n = 10) und gesundem Ösophagus Gewebe (n = 18) durchgeführt. Die Ergebnisse der Microarrayanalyse wurden mittels quantitativer real-time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) in einer zweiten und unabhängigen Kohorte (n = 71), bestehend aus Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus (n = 25), gesundem Ösophagus (n = 11), Adenokarzinomen des Ösophagus (n = 13), Adenokarzinomen des Magens (n = 15) und des Kolons (n = 7) validiert. Um die funktionelle Relevanz eines neu identifizierten Markergens zu verstehen, wurde dessen Expression mittels siRNA-vermittelten Knockdown in einer humanen Plattenepithelkarzinom-Zelllinie unterdrückt und die Wirkung dieser Behandlung mit Hilfe einer weiteren Mikroarray-Analyse überprüft. Ein Gen, das WD repeat Protein enthaltende Gen 66 (WDR66), erwies sich als hochsignifikant überexprimiert in Plattenepithelkarzinomproben (P < 0,0001). Eine hohe WDR66 Expression von solchen Karzinomen korrelierte signifikant mit schlechtem Überleben (P = 0,031) der Patienten mit Ösophagus- Plattenepithelkarzinomen. Multivariate Cox Regressionsanalyse zeigte, dass die WDR66 Expression ein unabhängiger prognostischer Faktor (P = 0,042) blieb. WDR66 Knockdown durch RNA-Interferenz hatte insbesondere Einfluss auf Veränderungen der Expression von Membran-Komponenten. In Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus im Vergleich zu gesundem Epithel wurde Vimentin stark exprimiert (P = 0,0008), während die Occludin Expression reduziert war (P < 0,0001). Die Microarray-Daten wurden mittels qRT-PCR und Western Blot Experimenten validiert. Der siRNA-vermittelte Knockdown von WDR66 führte außerdem zu einer Unterdrückung des Zellwachstums, zu reduzierter Zellmotilität und einer verstärkten Apoptose der Zellen nach Zugabe von Staurosporin und 5-Fluorouracil. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass WDR66 ein nützlicher Biomarker für die Risikostratifizierung von Patienten mit Ösophagus-Plattenepithelkarzinomen ist. Als positiver Modulator der Epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) spielt WDR66 vermutlich eine wichtige Rolle für Wachstum und Invasion von Ösophagus- Plattenepithelkarzinomen. Dafür sprechen auch die Ergebnisse unserer funktionellen Studien im in-vitro System. Darüber hinaus ist WDR66 möglicherweise ein neues Drug-Target für die Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus.