Differentielle Regulation der alternativen Promotoren des Endothelin- Konvertierungsenzyms-1 durch den kardialen Transkriptionsfaktor Nkx2.5

Abstract

Die fundamentale Bedeutung des Transkriptionsfaktors Nkx2.5 und dem Endothelin-Konvertierungsenzym-1 (ECE-1), für die Herzentwicklung konnte in zahlreichen Knock-out-Modellen der Maus gezeigt werden. In dieser Arbeit gelang zum ersten Mal der Nachweis einer funktionellen Interaktion zwischen Nkx2.5 und ECE-1. Als Voraussetzung einer Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor Nkx2.5 und den alternativen Promotoren des ECE-1 wurde zunächst die Koexpression auf Protein- (Nkx2.5) und mRNA-Ebene (Nkx2.5, ECE-1-Isoformen) in einer Kardiomyoblastenzellinie, H9c2, nachgewiesen. Darüber hinaus wurde erstmals das isoformspezifische Expressionsmuster und die Expression von Nkx2.5 in embryonalen Rattenherzanlagen und in Herzgewebeproben von Patienten mit angeborenem Herzfehlern untersucht. In allen untersuchten Gewebeproben konnte, ebenso wie in der Kardiomyoblastenzellinie H9c2, die Koexpression nachgewiesen werden. Mit Luziferase-Reporter-Assays, Site- directed Mutagenese und Bandshift-Analyse konnte nachgewiesen werden, daß Nkx2.5 die alternativen Promotoren des ECE-1 differentiell reguliert. In transient transfizierten Rattenkardiomyoblasten (H9c2) werden die spezifischen ECE-1b und -1c-Promotoren durch Koexpression mit dem Transkriptionsfaktor Nkx2.5 aktiviert, während der ECE-1a-Promotor supprimiert wird. Die Wechselwirkung mit den alternativen ECE-1-Promotoren scheint dabei über unterschiedlich Mechanismen, teils direkt - für ECE-1b - und teils indirekt - für ECE-1a und -1c - vermittelt zu sein, was durch die Einführung von Mutationen in die Nkx2.5-Konsensussequenzen und durch Untersuchung der Protein-DNA-Interaktion mittels Bandshift-Analyse nachgewiesen werden konnte. Die Ergebnisse der funktionellen Promotoranalyse und der Untersuchung der endogenen isoformspezifischen ECE-Expression in H9c2-Zellen, humanem fetalem und adultem Herzen und humanen Herzgewebeproben - mit einer schwächeren Expression der ECE-1a-Isoform - sind somit übereinstimmend. Das isoformspezifische Expressionprofil kann zumindest teilweise durch die Wirkung des endogenen Nkx2.5 auf die drei alternativen ECE-Promotoren, einer transkriptionellen Aktivierung des ECE-1b und einer transkriptionellen Repression des ECE-1a und ECE-1c erklärt werden. Vor dem Hintergrund der in der Literatur veröffentlichten Daten über die Expression von Nkx2.5 und ECE-1 im gesunden und insuffizienten Herzen unterstützen die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese, daß Nkx2.5 auch in vivo ein entwicklungsbiologisch relevanter transkriptioneller Regulator der myokardialen ECE-1-Expression sein könnte. Der erstmalige Nachweis einer Interaktion zwischen dem kardialen Transkriptionsfaktor Nkx2.5 und dem ECE-1 könnte auf der Ebene der transkriptionellen Kontrolle auch eine mögliche Erklärung u.a. für das Vorliegen konotrunkaler bei Patienten mit einer Mutation im Nkx2.5-Gen und für die Pathophysologie der Herzinsuffizienz sein.

Mouse knock-out models have established a fundamental role for the transcription factor Nkx2.5 and for the metalloprotease, endothelin- converting-enzyme-1 (ECE-1), in heart development. Here we demonstrate for the first time a functional link between Nkx2.5 und ECE-1. As a prerequisite for the interaction of the transcritpion factor Nkx2.5 and the alternative promotors of ECE-1 we gave evidence on protein (Nkx2.5) and on mRNA level (Nkx2.5, ECE-1 isoforms) for a coexpression in rat H9c2 cardiomyoblasts and on mRNA level in embryonic rat heart and heart tissue of patients with congenital heart disease. The coexpression could be shown in all tissue probes studied as well as in the rat H9c2 cardiomyblasts. Using luciferase reporter gene assays, site-directed mutagenesis and gel shift assays we showed that Nkx2.5 differentially regulates the alternative promotors of ECE-1 isoforms. In transiently transfected rat H9c2 cardiomyoblasts, the promotors specific for ECE-1b and ECE-1c are strongly activated by Nkx2.5 coexpression, whereas the ECE-1a promotor is downregulated. Functional analysis of ECE-1 promotor constructs, carrying point mutations in Nkx2.5 consensus sequences, and gel shift assays support a direct mechanism of activation in case of the ECE-1b promotor, whereas the ECE-1a and the ECE-1c promotor are overtly regulated indirectly. Expression of ECE-1 isoforms in H9c2 cells, the diseased human heart and in adult and fetal heart tissue probes on mRNA level is consistent with the functional promotor data showing a less pronounced expression of ECE- 1a. The isoform specific expression profile could be at least partly explained by the effect of endogenous Nkx2.5 in transcriptional activating the ECE-1b and transcriptional repressing the ECE-1a and 1c promotor. The results presented here - based on the background of the data on the expression of Nkx2.5 and ECE-1 in the normal and failing human heart - support the hypothesis that Nkx2.5 is a developmental relevant transcriptional regulator of myocadial ECE-1 expression in vivo. The interaction presented in this work provides a possible explanation of certain phenotypic aspects of patients with Nkx2.5 mutations and may also be of significance for the pathophysiology of heart failure.