Functional characterization of the MICOS subcomplex Mic60-Mic19 in mitochondrial crista junction formation

Abstract

The investigation of mitochondrial structure and function has developed into an active area of research. A lot of progress was made on understanding the role of mitochondria in energy production and apoptosis, but there is still a profound lack of knowledge how mitochondria obtain their specific shape required for proper function. In particular, the formation of invaginations of the inner mitochondrial membrane termed cristae involves a plethora of different proteins, but it has remained unclear how they contribute to the remodeling of cristae membranes. The newly identified mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) is crucial for the formation of crista junctions and mitochondrial inner membrane architecture. MICOS contains two core components. Mic10 shows membrane-bending activity, whereas Mic60 (mitofilin) forms contact sites between inner and outer membranes. In my PhD thesis, I show that Mic60 from the thermophile fungus Chaetomium thermophilum dimerizes via its coiled-coil region and deforms liposomes into thin membrane tubules, therefore displaying membrane-shaping activity. Furthermore, a membrane-binding site in the soluble intermembrane space-exposed part of Mic60 was identified. This membrane-binding site is formed by a predicted amphipathic helix between the conserved coiled-coil and mitofilin domains. The mitofilin domain negatively regulates the membrane-shaping activity of Mic60. It is also shown that the mitofilin domain of Mic60 strongly binds to the CHCH domain of Mic19. ITC experiments indicated that this high affinity interaction requires two conserved cysteines within the CHCH domain that form a predicted disulfide bridge. Binding of Mic19 to the mitofilin domain modulates the membrane remodeling activity. The Mic60-Mic19 subcomplex forms tetramers, which involves both the CHCH-mitofilin domain interactions, but also the coiled-coil domains of both proteins. Membrane binding and shaping by the conserved Mic60-Mic19 complex is crucial for crista junction formation, mitochondrial membrane architecture and efficient respiratory activity. Mic60 thus plays a dual role by shaping inner membrane crista junctions and forming contact sites with the outer membrane.

Die Existenz von Mitochondrien wurde bereits vor mehr als 100 Jahren bestätigt. Diesem Organell wird eine Vielzahl von wichtigen Aufgaben zugeschrieben, unter Anderem die Regulierung des programmierten Zelltodes (Apoptose), die Energieproduktion, die Verteilung von Phospholipiden und vielen mehr. Die Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion hat sich zu einem aktiven Forschungsgebiet entwickelt. Auch wenn in den letzten Jahren große Fortschritte zum Verständnis der mitochondrialen Funktion wie Apoptose und Energieproduktion gemacht wurden, so ist bis heute unklar, wie Mitochondrien ihre spezifische Form zur Erhaltung ihrer Funktion bilden. Insbesondere die typischen Einstülpungen der inneren Membran (cristae) beinhaltet eine Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen, jedoch wie diese zur Bildung von Cristae-Membranen beitragen, ist bisher unklar. Ein erst kürzlich entdeckter Proteinkomplex (MICOS) scheint eine entscheidende Komponente bei der Ausbildung von cristae und deren Übergang zur inneren Membran (cristae junctions) zu sein. MICOS enthält zwei Kernkomponenten. Während Mic10 Membran- Deformierungs-Aktivität zeigt, bildet Mic60 (mitofilin) die Kontaktstellen zwischen innerer und äußerer Membran. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal gezeigt, dass Mic60, aus dem thermostabilen Pilz Chaetomium thermophilum, über die Coiled-coil Domäne dimerisiert und die ursprünglich runden Liposomen in lange dünne Schläuche verwandelt. Zusätzlich wird gezeigt, dass neben Mic10, auch Mic60 eine aktive Rolle im Umbau von Membranen spielt. Zugleich wurde eine Membranbindestelle zwischen der Coiled-coil und der Mitofilin-Domäne identifiziert, welche durch eine vorhergesagte amphipathische Helix gebildet wird. Die Mitofilin-Domäne scheint die Membran-Deformierungs-Aktivität negativ zu beeinflussen. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Mitofilin-Domäne von Mic60 stark an die CHCH-Domäne von Mic19 bindet. Isothermale Titrationskalorimetrie-Experimente zeigen, dass diese hochaffine Wechselwirkung zwei konservierte Cysteine innerhalb der CHCH-Domäne erfordert, die eine vorhergesagte intramolekulare Disulfidbrücke bilden. Die Bindung von Mic19 an die Mitofilin-Domäne fördert die Membrane-Deformierungs-Aktivität. Weitere biochemische Analysen zeigen auch, dass der Mic60-Mic19-Subkomplex Tetramere bildet, die sowohl die CHCH-Mitofilin-Domänen als auch die Coiled- coil beider Proteine einschließt. Die Membranbindung aber auch deren Deformierung durch den konservierten Mic60-Mic19-Komplex ist für die Bildung der Cristae junctions und der mitochondrialen Membranarchitektur entscheidend, und reguliert auch die Aktivität der Atmungskette. Mic60 spielt also eine doppelte Rolle, indem es Cristae junctions aber auch Kontaktstellen zwischen der inneren und äußeren mitochondrialen Membran formt.